自閉癥家犬Shank3敲除模型

病理體征：

1、孤獨(dú)癥合并癥：

（1）運(yùn)動(dòng)能力：跑步機(jī)實(shí)驗(yàn)證明突變?nèi)嬖诓煌潭鹊倪\(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力損傷，此外所有突變體都不能夠爬樓梯，突變體均運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力異常。

（2）活動(dòng)與睡眠：通過(guò)活動(dòng)監(jiān)控儀實(shí)施24小時(shí)活動(dòng)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Shank3突變?nèi)归g活動(dòng)增加，睡眠碎片化；睡眠時(shí)間縮短，睡眠質(zhì)量差。

2、孤獨(dú)癥核心癥狀：

（1）狗狗同類社交：

單箱實(shí)驗(yàn)：同類社交“單箱”實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：突變?nèi)c陌生犬社交（嗅探、邀玩）時(shí)間明顯減少，甚至出現(xiàn)夾尾、退縮等社交壓力的表現(xiàn)，突變體在狗與狗社交能力方面存在缺陷。

（2）狗與人異類社交：

“求助”實(shí)驗(yàn)：突變?nèi)c人的社交互動(dòng)明顯減少，在“困境”時(shí)無(wú)法及時(shí)的通過(guò)眼神交流向人類發(fā)出求助，社交依賴性比較弱，社交缺陷。

（3）刻板行為：突變體在沒(méi)有皮膚炎癥的情況下，自我抓撓、舔舐、刨籠子等行為明顯增多，刻板行為明顯。

Shank3基因編輯犬純合F0代和雜合F1代在同類犬犬社交（經(jīng)典的“三箱”實(shí)驗(yàn)）、異類犬人社交中均存在社交缺陷（社交時(shí)間減少、社交壓力增加）、刻板重復(fù)性行為等孤獨(dú)癥核心癥狀；此外模型犬同樣存在運(yùn)動(dòng)能力減弱、睡眠障礙等合并癥狀。以上表型較好的重復(fù)了臨床孤獨(dú)癥患兒表型，是較為理想的孤獨(dú)癥研究的疾病動(dòng)物模型。

創(chuàng)新性：

1、本項(xiàng)目為首次利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)精神疾病家犬模型。

2、與非人靈長(zhǎng)類猴相比， 家犬的基因編輯技術(shù)成熟、成本低、繁殖發(fā)育快、便于表型分析。

3、家犬作為人類的伴侶動(dòng)物，性情溫順，社交行為豐富，特別適用于社交與情感方向的研究。

4、本項(xiàng)研究既有利于解析社交與情感這一重大神經(jīng)和認(rèn)知科學(xué)難題，也有利于重大精神疾病的病理機(jī)制解析，推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化。

應(yīng)用價(jià)值：

一、 利用模型犬，開(kāi)展相關(guān)課題研究，通過(guò)行為學(xué)表型、腦影像、分子檢測(cè)分析，深入研究孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制機(jī)理；

二、 利用模型犬，通過(guò)腦影像、分子檢測(cè)分析，為孤獨(dú)癥客觀診斷標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)；

三、 利用模型犬，開(kāi)展相關(guān)藥物有效性評(píng)價(jià)與新藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)：

1.評(píng)估藥物對(duì)孤獨(dú)癥刻板行為的影響；

2.評(píng)估藥物對(duì)社交障礙的影響；

3.評(píng)估藥物對(duì)睡眠、運(yùn)動(dòng)能力、注意力障礙的改善；

四、利用模型犬，開(kāi)展非藥物治療有效性實(shí)驗(yàn)與評(píng)價(jià)：

1.評(píng)估醫(yī)療器械、康復(fù)理療儀器對(duì)孤獨(dú)癥的治療效果；

2.評(píng)估外科手術(shù)、腦電干預(yù)對(duì)孤獨(dú)癥的治療效果；

3.評(píng)估干細(xì)胞對(duì)孤獨(dú)癥的治療效果；

4.評(píng)估社交訓(xùn)練等行為學(xué)教育對(duì)孤獨(dú)癥的治療效果。

北京希諾谷生物科技有限公司具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可資質(zhì)SYXK（京）2016-0049，模型制備過(guò)程中不涉及病毒等生物活性物質(zhì)。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用、處置均接受倫理委員會(huì)的監(jiān)督。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)設(shè)施運(yùn)作過(guò)程中充分考慮防疫和人員保護(hù)要求。

背景信息：

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)存在于所有族群中，平均患病率約1%。孤獨(dú)癥譜系障礙是一類神經(jīng)發(fā)育疾病，不同孤獨(dú)癥患者在自主生存能力、認(rèn)知和語(yǔ)言能力以及并發(fā)癥上存在巨大的表型異質(zhì)性 (Lord et al., 2000)，主要有兩大核心癥狀，即社會(huì)交流障礙和刻板重復(fù)性行為。這些癥狀在兒童早期出現(xiàn)并影響日常生活能力。孤獨(dú)癥影響到越來(lái)越多的家庭，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，已成為一個(gè)公共健康問(wèn)題。因此我們需要積極尋找孤獨(dú)癥的致病原因，根據(jù)孤獨(dú)癥的致病基因構(gòu)建動(dòng)物模型，闡明孤獨(dú)癥的發(fā)病機(jī)制，為疾病的有效診斷和早期干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

基因信息：

SHANK3是目前研究最深入的幾個(gè)孤獨(dú)癥致病基因之一，該基因突變導(dǎo)致的病例約占孤獨(dú)癥譜系障礙總病例的1%。含有SHANK3染色體區(qū)域的大片段缺失會(huì)導(dǎo)致22q13.3缺失綜合癥 (Phelan-McDermid Syndrome, PMS)。22q13.3缺失綜合癥病人缺失片段的大小可以從0.1 Mb到10 Mb不等，臨床癥狀主要為肌肉張力減退、發(fā)育遲緩、語(yǔ)言缺失或滯后以及智力障礙，其中75%的病人也被診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙。

通過(guò)對(duì)家犬的全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)在家犬中Shank3基因結(jié)構(gòu)與小鼠和人類相似，全部具有22個(gè)外顯子。 家犬Shank3基因第21號(hào)外顯子編碼一個(gè)富含脯氨酸的保守區(qū)域，該區(qū)域是孤獨(dú)癥患者發(fā)生突變的熱點(diǎn)。因此，我們針對(duì)第21號(hào)外顯子進(jìn)行基因編輯（sgRNA 2和3），同時(shí)針對(duì)第5和第21號(hào)外顯子兩個(gè)位點(diǎn)（sgRNA 1和3）誘導(dǎo)Shank3的無(wú)效等位基因。目前公司擁有Shank3 21號(hào)外顯子片段刪除、5~21號(hào)外顯子33Kb大片段刪除的F0代以及不同基因類型的大量雜合F1代。

1、制備SHANK3基因敲除自閉癥模型犬共需要實(shí)驗(yàn)用比格犬約100只，主要作為受精卵的供體和代孕母犬。實(shí)驗(yàn)犬的環(huán)境符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》要求。

2、制備SHANK3基因編輯模型犬，通過(guò)受精卵胞質(zhì)注射完成。顯微操作環(huán)境對(duì)空氣的潔凈度要求為10萬(wàn)級(jí)。用到的顯微操作系統(tǒng)包括倒置熒光顯微鏡（Nikon, eclipse ti-u）和顯微操作臂（nikon,NT-88-V3）。

3、制備SHANK3基因敲除模型，采用Cas9/CRISP基因編輯技術(shù)，主要的技術(shù)路線如下：判斷母犬發(fā)情，進(jìn)行配種，手術(shù)獲得受精卵；通過(guò)顯微注射將體外轉(zhuǎn)錄的cas9 mRNA和sgRNA同時(shí)注射到受精卵的胞質(zhì)中；將注射過(guò)的受精卵移植到同期發(fā)情的代孕母犬的輸卵管中；代孕母犬妊娠/分娩，得到F0代基因編輯犬；對(duì)F0代進(jìn)行基因鑒定，篩選基因編輯陽(yáng)性犬；通過(guò)繁育，獲得SHANK3基因編輯雜合子和純合子。

自閉癥研究概況

美國(guó)精神科醫(yī)師Kanner在1943年首次報(bào)道了11例自閉癥病人。自閉癥(autism spectrum disorder, ASD)存在于所有族群中，平均患病率約1%。自閉癥是一類神經(jīng)發(fā)育疾病，不同自閉癥患者在自主生存能力、認(rèn)知和語(yǔ)言能力以及并發(fā)癥上存在巨大的表型異質(zhì)性 (Lord et al., 2000)，主要有兩大核心癥狀，即社會(huì)交流障礙和刻板重復(fù)性行為。這些癥狀在兒童早期出現(xiàn)并影響日常生活能力。自閉癥影響到越來(lái)越多的家庭，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，已成為一個(gè)公共健康問(wèn)題。因此我們需要積極尋找自閉癥的致病原因，根據(jù)自閉癥的致病基因構(gòu)建動(dòng)物模型，闡明自閉癥的發(fā)病機(jī)制，為疾病的有效診斷和早期干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

自閉癥的致病原因仍有很多未知，多認(rèn)為遺傳因素起了主要作用，同時(shí)受環(huán)境因素影響。SHANK3是目前研究最深入的幾個(gè)自閉癥致病基因之一，該基因突變導(dǎo)致的病例約占自閉癥總病例的1% (Jiang andEhlers, 2013)。含有SHANK3染色體區(qū)域的大片段缺失會(huì)導(dǎo)致22q13.3缺失綜合癥 (Phelan-McDermid Syndrome,PMS)(Wilson et al., 2003)。22q13.3缺失綜合癥病人缺失片段的大小可以從0.1 Mb到10 Mb不等 (Dharet al., 2010)，臨床癥狀主要為肌肉張力減退、發(fā)育遲緩、語(yǔ)言缺失或滯后以及智力障礙，其中75%的病人也被診斷為自閉癥 (Jiang and Ehlers, 2013)。上述SHANK3相關(guān)疾病是因?yàn)殡s合突變?cè)斐傻膯伪秳┝坎蛔悖琒HANK3所在區(qū)域兩倍或三倍重復(fù)增加的病例被診斷患有自閉癥、注意缺陷多動(dòng)障礙 (Attention-deficithyperactivity disorder, ADHD) 以及精神分裂癥 (Failla et al., 2007; Moessneret al., 2007)，說(shuō)明SHANK3劑量增加也會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病。SHANK3基因的突變和橫跨SHANK3區(qū)域的大片段重復(fù)都會(huì)引起一系列神經(jīng)精神疾病，表明合適的SHANK3劑量對(duì)正常的大腦功能至關(guān)重要。

為了研究SHANK3突變的致病機(jī)制，研究者開(kāi)發(fā)了不同動(dòng)物模型。基因突變小鼠模型是研究人類SHANK3突變相關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)理的主流途徑，目前已開(kāi)發(fā)出14種不同突變類型的小鼠品系 (Zhao et al., 2017)，但其表型由于突變位點(diǎn)的不同而各有差異。Shank3突變小鼠的研究提示，突觸水平的缺陷是自閉癥病理機(jī)制的核心。最早的Shank3基因突變小鼠缺失了編碼ANK結(jié)構(gòu)域的序列 (外顯子4-9或4-7缺失) (Bozdagi et al., 2010; Peca et al.,2011; Wang et al., 2011)。對(duì)這些Shank3突變小鼠研究發(fā)現(xiàn)，海馬體CA1神經(jīng)元突觸后功能和可塑性異常，小鼠社交行為減少，新生小鼠超聲發(fā)聲減少 (Bozdagi et al., 2010)。姜永輝教授實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于開(kāi)發(fā)Shank3小鼠突變體模型 (Wang, X. etal., 2016; Wang et al., 2011)，并在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)Shank3基因進(jìn)行了詳細(xì)的分析 (Wang et al., 2014)。在缺失外顯子4-9的Shank3純合突變小鼠中，觀察到異常社交行為，刻板重復(fù)行為以及異常的學(xué)習(xí)記憶，紋狀體PSD組分中Homer1b/c、GKAP和GluA1的表達(dá)水平降低，而在海馬未發(fā)現(xiàn)類似的變化 (Wang et al.,2011)。在缺失了外顯子13-16 (編碼PDZ結(jié)構(gòu)域)的小鼠模型中，Shank3主要蛋白亞型缺失，突變體表現(xiàn)出重復(fù)理毛行為和社交缺陷 (Peca et al., 2011) 。

由于基因編輯技術(shù)在非人靈長(zhǎng)類的成功應(yīng)用，近年來(lái)猴也被用于研究自閉癥的模型（Liu et al., 2016; Chen et al., 2017; Zhao et al., 2017）。由于猴的繁殖周期長(zhǎng)，成本貴，表型檢測(cè)相對(duì)困難，因此難以廣泛用于疾病模型研究（Zhao et al., 2018），因而有必要開(kāi)發(fā)新的的自閉癥動(dòng)物模型。

（1）狗的社交行為和腦區(qū)功能與人類類似

狗在3萬(wàn)3千年前左右開(kāi)始在東亞的南部地區(qū)逐漸被人類馴化，馴化過(guò)程中最為顯著的特點(diǎn)是行為的轉(zhuǎn)變，特別是從懼怕人類到適應(yīng)并相信人類 (Wang et al., 2013; Wang et al., 2016)。作為第一個(gè)被馴化的動(dòng)物，狗在馴化過(guò)程中的心理已經(jīng)變化，狗擁有狼所不具有的與人聯(lián)系的方式 [1]。即使是小狗，也可以自發(fā)地對(duì)人類手勢(shì)做出反應(yīng)，例如指點(diǎn)線索，以找到隱藏的食物或玩具獎(jiǎng)勵(lì)，相比之下類人猿必須有豐富的經(jīng)驗(yàn)才能表現(xiàn)出類似的技能[2]。寵物狗與工作犬相比有更強(qiáng)的社會(huì)依賴性，說(shuō)明在狗的馴化過(guò)程中最重要的結(jié)果是狗傾向作為一個(gè)社會(huì)單元與人互動(dòng)[3]。狗的面部表情的變化與主人是否注意有關(guān)，而與食物的刺激無(wú)關(guān)，說(shuō)明狗在積極地與人類進(jìn)行溝通[4]。2012年，Gregory S. Berns等訓(xùn)練了兩只狗在沒(méi)有鎮(zhèn)靜劑或物理限制的情況下采集高質(zhì)量功能核磁共振（fMRI）圖像 [5]。2013年他們將訓(xùn)練的犬?dāng)?shù)目擴(kuò)大到13只，再次證實(shí)犬核磁共振是可行的 [6]。用同樣的聲樂(lè)和非聲樂(lè)刺激人類和狗，發(fā)現(xiàn)狗對(duì)聲音產(chǎn)生反應(yīng)的腦區(qū)和人類的前顳語(yǔ)音相關(guān)的區(qū)域相似 [7]。這些狗的社會(huì)行為學(xué)研究和腦影像研究揭示了狗與人類腦功能對(duì)比研究對(duì)揭示人類認(rèn)知、情感交流機(jī)制以及神經(jīng)和精神疾病發(fā)病機(jī)理等具有重要的科學(xué)價(jià)值。

（2）家犬基因編輯與克隆技術(shù)進(jìn)展

不同于小鼠、牛、羊等生物，狗一直被認(rèn)為是世界上最難被克隆的動(dòng)物之一，2005年，世界首例體細(xì)胞克隆犬“史努比”在韓國(guó)誕生(Lee et al., 2005)。2015年，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)教授在世界上首次成功應(yīng)用CRISPRs/Cas9系統(tǒng)對(duì)狗的Myostatin基因進(jìn)行基因編輯，該基因編碼肌肉生長(zhǎng)抑制素 (Zou et al.,2015)。2018年, 馮沖等也利用此系統(tǒng)對(duì)ApoE基因進(jìn)行編輯，成功得到純合突變體, 而且對(duì)此基因編輯狗成功進(jìn)行了克隆（Feng et al.,2018)。ApoE在脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝中發(fā)揮主要作用，這一基因被敲除造成狗的血漿膽固醇升高，可能誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。我國(guó)在家犬基因編緝和克隆狗的構(gòu)建方面走在世界前列。

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