尾部懸吊模擬失重誘導大鼠學習記憶障礙模型

1 評價標準

（1） 行為學評價：

① 獎勵性條件反射實驗

鼻觸次數：動物經過訓練后形成信號燈亮與獎賞物質之間條件反射，屬于巴普洛夫經典條件反射范疇，反映了學習、理解、推理等方面的認知功能。造模成功動物鼻觸次數顯著降低。

② 水迷宮實驗

逃避潛伏期和總游程：定航能力評價指標，反映動物空間參考記憶。造模成功動物逃避潛伏期和總游程顯著增加。

穿臺次數及目標象限游程：探索能力的評價指標，反映動物空間參考記憶。造模成功動物穿臺次數及目標象限游程顯著降低。

③穿梭實驗

主動穿梭次數、被動穿梭次數、安全區時間：反映動物聯想學習記憶能力。模型動物主動穿梭次數和安全區時間顯著性降低。

（2）分子生物學評價：

①HPA軸相關指標檢測

皮質酮、ACTH兩種激素水平：皮質酮和ACTH是由HPA軸釋放的激素，其水平高低反映HPA軸的功能。模型動物皮質酮、ACTH兩種激素水平顯著高于正常動物，顯示出HPA軸的亢進。

② 蛋白表達檢測結果

CREB和BDNF蛋白表達量：與神經元細胞的生長和發育及突觸可塑性密切相關。模擬失重組動物海馬CREB和BDNF蛋白表達量降低，顯示其海馬依賴性學習記憶的損傷。

2 技術難點

（1）尋找適當角度并選擇正確的綁尾方式，保證造模成功的同時盡可能降低對動物機體的損傷。

（2） 建立無人實時監控裝置，降低動物的尾吊狀態未知性，以及時糾正脫落或體態改變的動物。

3 總結

經過兩周以上的尾部懸吊可誘導大鼠（Wistar大鼠、SD大鼠）學習記憶障礙，可作為特因環境下失重模擬誘導學習記憶障礙的方法。與其他應激方式不同，尾部懸吊針對于航天特因環境下的應激，并很好地模擬了失重效應。通過尾部懸吊的方式建立模擬失重記憶障礙模型，發揮地面模擬實驗的重要作用，為航天特因環境下，學習記憶障礙機理研究、防護和藥物研究提供客觀穩定的動物模型，為航天任務順利進行提供科技支撐。

本實驗采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1 實驗材料

（1）藥品與試劑：

CORT Elisa試劑盒，ACTH Elisa 試劑盒，均購自美國Rapid BioLab公司。CREB(48H2) rabbit mAb（Cell Signaling）、PCREB (ser133) Antibody（Cell Signaling）、BDNF Antibody (N-20):sc-546（Santa Cruz Bio-technology）、Peroxidase-conjugated goat(anti-mouse)（北京普利萊生物技術有限公司）、Peroxidase-conjugatedgoat(anti -rabbit)Mouse anti-GAPDH antibody（北京中杉金橋生物技術有限公司）、Prestained Protein Ladder(40-300 kDa)（北京中杉金橋生物技術有限公司）

（2）儀器：

①行為學檢測：大鼠水迷宮實時檢測系統、獎勵性條件反射測試系統(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓練中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研制)

②分子生物學檢測：電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）、離心機（德國Eppendorf公司）、全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）、制冰機（意大利Icematic公司）、電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、超聲細胞破碎儀（美國Sonics公司）、TS-1脫色搖床（江蘇海門其林貝樂公司）、雙垂直板電泳槽（美國Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝膠成像（美國Bio-Rad公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價方法

（1）行為學評價:

①獎勵性條件反射實驗:

利用獎勵性條件反射測試系統，對造模實驗動物進行檢測。應用自由適應模式，此模式為信號燈亮，獎賞物質給出。以動物探頭次數（NP）為評價指標。動物探頭喝水反應了動物對飲水盒的位置記憶與探索興趣程度，此階段訓練的目的使動物得到獎賞物質可在飲水盒內獲得的信息；使動物將信號燈亮與獎賞物質之間形成經典條件反射。

②水迷宮實驗

空間定航實驗:實驗期間，保持水溫在（23～25）℃，實驗室物品及人員位置固定作為大鼠空間參照物。大鼠先放在位于第三象限內的平臺上適應15 s，然后分別從第一、二兩個象限放入迷宮中，每次實驗時間為90 s，后適應15 s。訓練動物找到藏于水面的平臺并爬上平臺。將動物入水到尋臺成功所需時間記作潛伏期。尋臺失敗潛伏期與實驗設定時間相同。用潛伏期評價動物空間定位學習能力。

空間探索實驗:定位航行實驗結束次日，拆除平臺，選擇第一象限作為入水象限，通過動物在90 s內穿過原平臺位置的次數、原平臺象限游程比率及時間比率（即動物在原平臺象限的游程及時間占總游程及總時間的比率）來評價動物的空間記憶能力。

（2）分子生物學檢測

①HPA軸相關指標檢測

ELISA試劑盒法。按照試劑盒說明書進行操作，操作步驟如下：試劑盒平衡至室溫（20-25℃）：拿出包被一抗的96孔酶標板,并稀釋洗滌液：加入25μL血清標本與相應反應孔中；每空加入200μL酶聯五，室溫下反應60min；甩盡反應液，用洗滌液洗板5次；每孔加入顯色液200uL，37℃下反應15min；每孔加入終止液100L：15min內用酶標儀測定450nm處波長的吸光度值。用半對數做圖法繪制標準曲線,由此計算血清中激素濃度。靈敏度：ACTH2.5pg/ml，皮質酮0.7nmol/L，批件差10%-15%。

② 蛋白含量檢測

（a）組織蛋白的提取

每組各3個海馬組織，稱重，每10mg組織加入100 μl預冷的裂解液；冰上超聲破碎，制成10%組織勻漿。再置冰上裂解30 min：將組織勻漿液轉移到1.5ml離心管，4℃離心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法測定蛋白濃度；加4x上樣緩沖液，沸水浴變性5min，快速冷卻，分裝，－80℃凍存備用。

（b）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制分離膠。將分離膠注入垂直放置的玻璃板縫隙中，頂層加入1cm高度的異丙醇覆蓋膠面。室溫靜置至凝膠與異丙醇之間有一水平的清晰界面，倒掉異丙醇，用濾紙凝膠頂部液體。CREB選用10%的分離膠，BDNF均選用12%的分離膠。

配制濃縮膠。將配好的濃縮膠注入玻璃板問隙。立即插入齒梳，室溫靜置30 min左右。

電泳。將凝膠插入垂直電泳槽中，小心拔出梳子，加滿電泳緩沖液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和樣品（8μl/孔）；電壓80 V，當溴酚藍進入分離膠后,將電壓增至120V，繼續電泳至溴酚藍接近分離膠底部。關閉電源，取下凝膠，進行轉膜。

（c）轉膜

按照凝膠大小，剪PVDF膜和兩張Bio-RAD專用濾紙，將剪好的濾紙，海綿墊和夾子在電轉移緩沖液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在轉膜夾中，從負極（黑色）到正極（白色）依次排放：海綿墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—海綿墊，蓋好正極板，插入電轉移槽，倒入電轉移液，蓋上蓋；冰浴電轉，350mA, 1h。

（d）封閉及抗原抗體反應

封閉。電轉完畢后，將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖1h。

孵育一抗。將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，4℃過夜。一抗雜交后用10%TBST洗10 min，每次溫振搖，共3次。

孵育二抗。洗滌后，將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，室溫孵育1h。二抗雜交后用10%TBST洗滌10 min，每次室溫振搖，共３次。

（e）顯色

將A液和B液按1：1比例混勻配制化學發光液，避光保存；將膜放于剪好的自封袋中，均勻滴加發光液，暗處放置3min；置于凝膠電泳顯色儀中照相。

3 評價結果

（1）行為學結果

①獎勵性條件反射實驗

造模14天后從第1天起，與正常組相比，尾吊組鼻觸次數減少（P＜0.05），尾平組在第2天與正常組形成差異（P＜0.01），尾平組與尾吊組在第3天差異出現顯著性（P＜0.01）；28天時，與正常組和尾平組相比，尾吊組的鼻觸次數顯著性的減少（P＜0.01），尾平組與正常組間無差異。

圖4 模擬失重對大鼠獎勵性條射鼻觸次數的影響

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較$P＜0.05，$$P＜0.01。

②水迷宮實驗

對逃避潛伏期的影響：14天時，與正常組和尾平組相比，尾吊組的逃避潛伏期明顯增加，從第2天開始出現差異（P＜0.01），尾吊組與正常組無差異；28天時，尾吊組與正常組和尾平組相比，逃避潛伏期顯著增加，從檢測第1天起，尾吊組與正常組和尾平組一直形成顯著性差異（P＜0.01），形成較穩定的顯著性差異，尾平組與正常組無差異。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

對總游程的影響：14天時，尾吊組與正常組相比，總游程有明顯的增加，從第3天起差異形成顯著性（P＜0.01），與尾平組相比，從第3天開始出現差異（P＜0.05）并與第4、5天差異形成顯著性（P＜0.01），尾平組與正常組無差異；28天時，尾吊組與正常組和尾平組相比，總游程顯著增加，從第3天起差異出現顯著性（P＜0.01），并形成較穩定的差異，尾平組與正常組無差異。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

同時，采用穿梭實驗檢測發現，尾吊動物的聯想學習記憶能力降低（14天造模后），表現在主動穿梭次數、安全區時間等指標上。

（2）分子生物學檢測

①HPA軸相關指標檢測

與正常組相比，尾吊顯著性地增加了血清中皮質酮和ACTH的含量（P＜0.01），可引起下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（HPA軸）功能亢進。

注：與正常組比較，**P＜0.01。

② 蛋白表達檢測結果

以GAPDH為標準,與正常組相比，尾吊組CREB和BDNF的表達量顯著減少（P＜0.01）。

1模擬失重實時監控裝置的建立

裝置由多個箱體單元組成，每一個箱體單元包括至少一個尾吊籠，尾吊籠設置在箱體單元內，用于提供動物尾部懸吊實驗的空間；每一個箱體單元的上方安裝有攝像裝置，用于獲取箱體單元中動物模擬失重尾部懸吊實驗時的長期、動態、連續、實時的自發活動圖像信息；每一個尾吊籠的上方安裝有懸吊裝置，用于與動物尾部連接；每一個尾吊籠上方安裝有脫落檢測裝置，用于在動物尾部懸吊實驗時，檢測動物尾部懸吊是否脫落，且在檢測到動物尾部脫落時，向計算機系統發出報警信號；以及計算機系統，用于接收攝像裝置發送的圖像信息和所述脫落檢測裝置發送的報警信號，并將報警信號發送給指定的實驗人員。

與以往尾吊籠相比，此次的模擬失重裝置具有以下特點：

（1）箱體單元包括至少一個尾吊籠，實現一個攝像裝置同步對箱體單元中的至少一個尾吊籠中的動物的自主活動進行實時監控及圖像提取，而且還可在攝像裝置的鏡頭之前設置紅外透鏡，通過該紅外透鏡濾除其他光線的干擾，提高圖像的信噪比。

（2）可通過脫落檢測裝置檢測動物尾部懸吊是否脫落，通過計算機系統將報警信號發送給指定的實驗人員，實現脫落報警，使得實驗人員可及時進行實驗干預。

（3）通過在尾吊籠外側面設置雙瓶飲水裝置，可為動物的糖水偏愛實驗檢測提供條件，實現對抑郁或類抑郁行為的檢測。

（4）箱體單元中的尾吊籠之間可設置活動隔板層，實現動物的交流受阻隔離狀態和非隔離狀態的互換。

總而言之，本裝置的建立充分考慮到了動物模型多樣本量、時間長、人工觀察工作量大，脫落預處理不及時等因素，可實現對尾部懸吊的動物的自主活動的實時監測、脫落報警以及為抑郁或類抑郁行為檢測提供條件。同時提供了路程、速度、時間三個指標，運動與靜息兩種狀態的分時、分段、分區等數據，以及動物的尾部懸吊的狀態等信息，能實時獲取、保存和輸出動物的實時活動圖像，從而確保了實驗的穩定性、可靠性。

注：11：箱體單元；12：尾吊籠；13：攝像裝置；14：脫落檢測裝置；15：食物盒；16：雙瓶飲水裝置；17：發光二極管；18：活動隔板層；19：柵網；20：廢物收集盒；21：多路圖像卡；22：實驗軟件；23：接口卡；24：傳輸接口；31：脫落檢測單元；32：消息收發單元。

2模型的誘導方法

（1）動物：SPF級，Wistar大鼠、SD大鼠（200±10 g），雄性

（2）材料：醫用橡皮膏、帆布手套、傷濕止痛膏

（3）儀器：動物模擬失重尾部懸吊實時監測裝置(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓練中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研制)

（4）誘導過程：大鼠尾吊采用動物模擬失重尾部懸吊實時監測裝置進行，每個箱體尺寸為26㎝×26㎝×30㎝。尾吊方法簡述如下：使大鼠鉆入帆布手套，僅使其尾部外露。將傷濕止痛膏剪成約長7cm，寬約1cm的長條狀，將其中間段1/3長度延長軸方向對疊，兩頭端1/3處粘在大鼠距尾根部約1cm處，使其成一個環形結構，將醫用橡皮膏螺旋形包裹在其外部，避免滑脫。將一頭帶鉤的金屬鏈條鉤住環狀膏藥，另一頭穿過尾吊儀微動開關的環形掛圈，根據需要調節鏈條長度，并用金屬夾將鏈條固定，使動物軀干與尾吊籠底部約成-30°角，使大鼠借助前肢可在尾吊籠內360°自由活動和自由飲食飲水。行為學檢測期間應保持大鼠處于造模時的尾吊狀態，在行為學檢測時應盡量減少動物的非尾吊時間，取下后及時檢測，檢測完后及時恢復尾吊。

隨著我國在載人航天工程事業取得重大成功，空間站工程也正式啟動。空間站工程要求航天員必須具備較長時間的連續在軌駐留能力，必須克服長時間航天飛行因受到失重、晝夜節律改變、狹小密閉環境等多種因素影響所導致的一系列諸如心血管功能障礙、失重骨丟失、肌肉萎縮、免疫功能下降等失重生理效應。同時，航天環境可造成認知功能及反應判斷能力下降，直接影響航天員對信息處理可靠性，甚至造成重大操作失誤，對航天工作帶來的危害則難以估量［1-3］。

在受科學技術、經費等限制，航天飛行難以長期、重復進行，地面模擬失重的實驗方法的建立就顯得尤為重要。Darren M. Lipnicki 等分析了25例健康男性受試者在60天頭低位臥床前及臥床期間（第51天）LGT的行為表現，發現臥床前及期間受試者的決策能力明顯改變[4]。MesserottiBenvenuti 等將22 名男性受試者隨機分為對照組及頭低位臥床組，3小時后對受試者進行圖片觀察任務測試，結果表明頭低位臥床會明顯影響了受試者的學習能力[5]。使用功能性磁共振fMRI方法測試結果表明失重狀態時，興奮腦區的激活范圍和強度有明顯的減少[6]。吳大蔚等觀察了尾部懸吊模擬微重力對小鼠學習記憶能力的影響，發現尾吊7d及12d小鼠空間記憶能力降低[7]。

實驗動物在地面模擬失重的研究中得到了廣泛的應用。對于動物實驗，起初是采用全身或局部限動的方法模擬失重狀態下的低活動度，逐漸發展到采用頭低位的方法模擬失重環境下的血液頭向分布生理學效應[8]。頭低位尾部懸吊模擬失重應激程度較輕，可長時間模擬失重狀態。該模型的研究可為航天等特因環境下，學習記憶障礙機理研究、防護和藥物研究提供實驗基礎。

參考文獻：

[1] Li S, Wang C,Wang MW, et al. Impairment of the spatial learning and memory induced bylearned helplessness and chronic mild stress[J]. Pharmacology Biochemistry andBehavior, 2006, 83(2):186-193.

[2] McTeague LM, LangPJ. The anxiety spectrum and the reflex physiology of defense: fromcircumscribed fear to broad distress[J]. Depress Anxiety, 2012, 29:264-281.

[3] Conrad CD. Acritical review of chronic stress effects on spatial learning and memory[J]. ProgrNeuro-Psychopharmacol Biol Psychiat, 2010, 34:742-755.

[4]Lipnicki, DM, Gunga, HC, Belavy, DL, dFelsenberg, D. Decision making after 50days of simulated weightlessness [J]. Brain research, 2009, 1280: 84-89.

[5] MesserottiBenvenuti, S, Bianchin, M, and Angrilli, A. Effects of simulated microgravityon brain plasticity: A startle reflex habituation study [J]. Physiology &behavior, 2011, 104:503-506.

[6] 劉剛, 金真, 李科, 曾亞偉, 李勇枝. 模擬失重狀態對人腦認知功能的影響 [J]. 中華航空航天醫學雜志,2005,16(3): 161-164.

[7] 吳大蔚, 沈羨云, 董頎, 等. 尾部懸吊對小鼠學習記憶的影響 [J]. 航天醫學與醫學工程. 2000,13(4): 244-248.

[8] 董麗, 王瓊, 劉新民, 楊思進.地面模擬失重實驗方法概況[J].中國實驗動物學報, 2013,21(05): 90-94.