尾部懸吊模擬失重誘導大鼠抑郁模型

1 評價標準

（1） 行為學評價：

① 體重：模型動物體重顯著性降低。

② 空場實驗：

運動路程、運動速度、運動時間：屬于水平運動指標，反映動物的活動度。模型動物運動路程、運動速度、運動時間均降低，顯示活動度降低。

站立次數：屬于垂直運動指標，反映了動物對新奇環境的好奇程度。模型動物站立次數減少，對新奇環境的好奇程度降低。

③ 新奇事物探索實驗

潛伏期、探索次數和時間：反映動物在新奇環境中的探究能力和探索興趣。模型動物模型組大鼠接觸新奇事物的潛伏期較對照組延長同樣反映動物在新奇環境中的探究能力下降，而探索次數和時間的減少表明動物對新奇事物的探索興趣降低。

④ 強迫游泳實驗

不動時間、攀爬次數：反映動物在不可逃避的環境中的絕望情緒。模型組大鼠強迫游泳不動時間較對照組延長，攀爬次數減少，在一定程度上揭示了尾吊大鼠在不可逃避的環境中產生絕望情緒。

（2）分子生物學評價：

①HPA軸相關指標檢測

皮質酮、ACTH兩種激素水平：皮質酮和ACTH是由HPA軸釋放的激素，其水平高低反映HPA軸的功能。模型動物皮質酮、ACTH兩種激素水平顯著高于正常動物，顯示出HPA軸的亢進。

② 蛋白表達檢測結果

BDNF蛋白表達量：與神經元細胞的生長和發育及突觸可塑性密切相關，是目前研究與抑郁癥發生及轉歸關系最為密切的因子之一。模擬失重組動物BDNF蛋白表達量降低。

2 技術難點

（1)尋找適當角度并選擇正確的綁尾方式，保證造模成功的同時盡可能降低對動物機體的損傷。

（2）建立無人實時監控裝置，降低動物的尾吊狀態未知性，以及時糾正脫落或體態改變的動物。

3 總結

1周到4周的造模時長均可選用，均可以誘導穩定的大鼠（Wistar大鼠、SD大鼠）抑郁動物模型，出于動物保護倫理的角度，推薦根據實驗選用周期較短的造模時長。尾吊模型的抑郁表現為活動度降低，探索興趣與探索能力減退，易產生絕望情緒，但并未表現出快感缺失。與其他應激方式不同，尾部懸吊針對于航天特因環境下的應激，并很好地模擬了失重效應。目前對于模擬失重所致抑郁模型鮮有報道。通過對尾吊模型的進一步深入研究，為航天特因環境致抑郁癥的發生及治療提供穩定可靠的動物模型，為我國后續中長期飛行提供技術和方法儲備。

本實驗采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1 材料

（1）試劑：大鼠皮質酮（CORT）酶聯免疫分析測試盒、大鼠促腎上腺皮質激素（ACTH）酶聯免疫分析測試盒（RD公司，USA），BDNF Rabbit Ab （Cell Signaling公司）

（2）儀器：

①行為學檢測：大鼠空場實驗實時檢測系統、大鼠強迫游泳檢測裝置（）

② 分子生物學檢測

HPA軸相關指標檢測：電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）、電熱溫培養箱（上海科學儀器有限公司）、離心機（德國 Eppendorf公司）、全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

蛋白印跡法實驗：雙垂直板電泳槽、轉移電泳槽、電泳儀、ChemiDoc XRS +Imager (均為美國BioRad公司)

2 評價方法

（1）行為學評價:

①空場實驗

實驗系統由測試箱和圖像采集分析系統構成。測試箱由4個鐵制的具有一定斜度的黑色圓柱形桶組成（直徑80cm；高50cm），整個圓桶活動場中心內部直徑為20cm的中央區，在圓柱形桶的正上方安裝有攝像頭，通過圖像采集系統將動物自主活動狀態和運動軌跡傳送至計算機，軟件對采集到的信息進行分析處理。參數設置結束后，將大鼠沿桶壁放入測試箱內，測試大鼠10min內的活動度，并人工記錄前5min內大鼠的站立次數（兩前肢離開水平面的次數）。每只大鼠測試結束后對測試桶進行清潔處理，方可進行下一次測試，測試期間保持環境安靜。

②新奇事物探索實驗

空場實驗結束后24h，各大鼠在進行空場實驗的同一測試箱內進行新奇事物探索實驗。在測試箱中央處（圓心）放入一藍色的鐵制圓形柱狀體（半徑4cm，高10cm），將大鼠面對桶壁放入測試箱內，記錄大鼠第一次接觸圓柱體的時間（潛伏期）以及10min內的探索總次數，若10min內大鼠無探索行為則潛伏期記為10min。以大鼠的口鼻處離新奇物體的距離小于2cm或直接接觸物體為探索行為的判斷標準。

③強迫游泳試驗

實驗分2天進行。第1天將大鼠置于盛有自來水的玻璃缸(直徑18 cm，高46 cm) 中，水深23 cm，水溫25℃，游泳15 min 后取出，置于電熱取暖器旁用干布將身體上水擦拭后烤干。第2天再次將大鼠放入上述同等條件水缸中，記錄大鼠在5 min內的累計不動時間。

（2）分子生物學檢測

①HPA軸相關指標檢測

本試劑盒采用雙抗體夾心法測定血清中皮質酮(CORT) /促腎上腺皮質激素(ACTH)水平。用純化的大鼠CORT/ACTH抗體包被微孔板，向包被單抗的微孔中依次加入CORT/ACTH，再與HRP標記的CORT/ACTH抗體結合，形成抗體抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后，底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色。并在酸的作用下最終轉化成黃色。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。通過標準曲線計算血清中CORT/ACTH濃度。

② 蛋白印跡法實驗

將皮層組織稱重，加入預冷的蛋白裂解液（1:9），裂解液含1% PMSF，1% Cocktail和1%磷酸酶抑制劑。冰上超聲破碎，充分裂解后，制備成10%組織勻漿。離心取上清，留部分檢測蛋白質濃度，其余蛋白樣品與5x上樣緩沖液（比例為4:1）混勻，100 ℃煮5 min（煮前用封口膜封閉EP管口，以防煮沸時炸開），將煮好的樣品在冰中迅速冷卻，放入－20℃保存。取蛋白樣品50μg，上樣，以80V進行電泳，約30 min后進入分離膠，此時溴酚藍被壓成一條線；調至120V，直至嗅酚藍染料前沿至膠底。以320 mA，2 h，轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PVDF膜用一抗（BDNF）孵育4℃過夜。次日加二抗，室溫孵育1 h，PVDF膜經SuperECL Plus超敏發光液顯色，放入BIORAD凝膠成像儀檢測化學發光并照相。

3 評價結果

（1）行為學結果：

①體重結果

如表所示，尾吊1周，2周，3周，4周均會導致動物體重下降，與對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）。

表1 不同造模時長模擬失重模型體重比較(單位：g)

注：與相應對照組比較，*P<0.05。

②空場實驗

由下圖可見，對于不同時長尾吊的動物，在自主活動檢測中，對照組大鼠總路程，平均速度，運動路程，運動總時間，站立次數，中央區運動路程，中央區運動時間，中央區運動速度，中央區靜息時間，周邊區運動路程，周邊區運動時間，周邊區運動速度較模型組多（P<0.05）。而靜息總時間，周邊區靜息時間較模型組少（P<0.05）。

圖4 不同時長尾吊對動物自主活動的影響

注：（a）總路程；（b）平均速度；（c）運動路程；（d）運動時間；（e）靜息總時間；（f）站立次數。與相應對照組比較，&P＜0.05。

圖5 不同時長尾吊對動物中央區自主活動的影響

注：（a）中央區運動路程；（b）中央區運動時間；（c）中央區運動速度；（d）中央區靜息時間。與相應對照組比較，&P＜0.05。

圖6 不同時長尾吊對動物周邊區自主活動的影響

注：（a）周邊區運動路程；（b）周邊區運動時間；（c）周邊區運動速度；（d）周邊區靜息時間。與相應對照組比較，&P＜0.05。

③新奇事物探索實驗

經過1-4周的尾吊造模后，模型組探索新奇物體的潛伏期增加，而探索次數及探索時間減少（P<0.05）

圖7 不同時長尾吊對動物新奇事物探索的影響

注：（a）探索潛伏期；（b）探索次數；（c）探索時間。與相應對照組比較，^&P＜0.05

④強迫游泳試驗

在強迫游泳檢測中，從1周到4周的模型動物不動時間均顯著性增加，攀爬次數減少，表明經歷1周的造模后的動物在已出現絕望行為表現，隨時間延長，這種表現并未變化（P<0.05）。

圖8 不同時長尾吊對動物強迫游泳實驗的影響

注：（a）不動時間；（b）攀爬次數。與相應對照組比較，^&P＜0.05。

另外，通過糖水偏愛實驗檢測模型動物是否出現快感缺失，并未發現模型動物與正常動物間的差異。

（2）分子生物學檢測

①HPA軸相關指標檢測

血清CORT和ACTH測定，與對照組皮質酮(26.44 ± 5.58) ng?L-1，促腎上腺皮質激素(49. 52 ±5. 16) ng?L-1比，尾吊14 d模擬失重模型組大鼠血清中皮質酮(47. 62 ±9.34 ) ng?L-1升高(P<0.05)，促腎上腺皮質激素(53.20 ±4.57) mg?L-1升高(P<0.01)。

②蛋白表達測定

與正常組相比，尾吊組BDNF的表達量顯著減少（P＜0.01）。

圖9 模擬失重對BDNF蛋白表達的影響

注：1）與空白組相比，P<0.01

1模擬失重實時監控裝置的建立

裝置由多個箱體單元組成，每一個箱體單元包括至少一個尾吊籠，尾吊籠設置在箱體單元內，用于提供動物尾部懸吊實驗的空間；每一個箱體單元的上方安裝有攝像裝置，用于獲取箱體單元中動物模擬失重尾部懸吊實驗時的長期、動態、連續、實時的自發活動圖像信息；每一個尾吊籠的上方安裝有懸吊裝置，用于與動物尾部連接；每一個尾吊籠上方安裝有脫落檢測裝置，用于在動物尾部懸吊實驗時，檢測動物尾部懸吊是否脫落，且在檢測到動物尾部脫落時，向計算機系統發出報警信號；以及計算機系統，用于接收攝像裝置發送的圖像信息和所述脫落檢測裝置發送的報警信號，并將報警信號發送給指定的實驗人員。

與以往尾吊籠相比，此次的模擬失重裝置具有以下特點：

（1）箱體單元包括至少一個尾吊籠，實現一個攝像裝置同步對箱體單元中的至少一個尾吊籠中的動物的自主活動進行實時監控及圖像提取，而且還可在攝像裝置的鏡頭之前設置紅外透鏡，通過該紅外透鏡濾除其他光線的干擾，提高圖像的信噪比。

（2）可通過脫落檢測裝置檢測動物尾部懸吊是否脫落，通過計算機系統將報警信號發送給指定的實驗人員，實現脫落報警，使得實驗人員可及時進行實驗干預。

（3）通過在尾吊籠外側面設置雙瓶飲水裝置，可為動物的糖水偏愛實驗檢測提供條件，實現對抑郁或類抑郁行為的檢測。

（4）箱體單元中的尾吊籠之間可設置活動隔板層，實現動物的交流受阻隔離狀態和非隔離狀態的互換。

總而言之，本裝置的建立充分考慮到了動物模型多樣本量、時間長、人工觀察工作量大，脫落預處理不及時等因素，可實現對尾部懸吊的動物的自主活動的實時監測、脫落報警以及為抑郁或類抑郁行為檢測提供條件。同時提供了路程、速度、時間三個指標，運動與靜息兩種狀態的分時、分段、分區等數據，以及動物的尾部懸吊的狀態等信息，能實時獲取、保存和輸出動物的實時活動圖像，從而確保了實驗的穩定性、可靠性。

圖1 箱體結構圖

圖2 裝置系統信號連接示意圖

注：11：箱體單元；12：尾吊籠；13：攝像裝置；14：脫落檢測裝置；15：食物盒；16：雙瓶飲水裝置；17：發光二極管；18：活動隔板層；19：柵網；20：廢物收集盒；21：多路圖像卡；22：實驗軟件；23：接口卡；24：傳輸接口；31：脫落檢測單元；32：消息收發單元。

2模型的誘導方法

（1）動物：SPF級，Wistar大鼠、SD大鼠（200±10 g），雄性

（2）材料：醫用橡皮膏、帆布手套、傷濕止痛膏

（3）儀器：動物模擬失重尾部懸吊實時監測裝置(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓練中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研制)

（4）誘導過程：大鼠尾吊采用動物模擬失重尾部懸吊實時監測裝置進行，每個箱體尺寸為26㎝×26㎝×30㎝。尾吊方法簡述如下：使大鼠鉆入帆布手套，僅使其尾部外露。將傷濕止痛膏剪成約長7cm，寬約1cm的長條狀，將其中間段1/3長度延長軸方向對疊，兩頭端1/3處粘在大鼠距尾根部約1cm處，使其成一個環形結構，將醫用橡皮膏螺旋形包裹在其外部，避免滑脫。將一頭帶鉤的金屬鏈條鉤住環狀膏藥，另一頭穿過尾吊儀微動開關的環形掛圈，根據需要調節鏈條長度，并用金屬夾將鏈條固定，使動物軀干與尾吊籠底部約成-30°角，使大鼠借助前肢可在尾吊籠內360°自由活動和自由飲食飲水。行為學檢測期間應保持大鼠處于造模時的尾吊狀態，在行為學檢測時應盡量減少動物的非尾吊時間，取下后及時檢測，檢測完后及時恢復尾吊。

圖3 模擬失重尾部懸吊實時監測裝置圖

中長期飛行任務時，航天員處于持續的微重力暴露、高負荷作業、單調寂寞的狹小活動空間等復合環境中，使得航天員身心受到極大挑戰，極易引起機體神經精神系統、循環系統及免疫系統等系統的生理應激反應，導致抑郁等精神行為的改變[1-3]。失重作為一種引起應激的物理刺激可引起以下生理效應：如血液頭向分布、心血管系統和支持系統去載荷、重力的感受器刺激缺乏等，對由此而產生的航天飛行綜合征的發生機制及對抗措施是亟待解決的航天醫學難點問題[4]。

在受科學技術、經費等限制，航天飛行難以長期、重復進行，地面模擬失重的實驗方法的建立就顯得尤為重要。實驗動物在地面模擬失重的研究中得到了廣泛的應用。對于動物實驗，起初是采用全身或局部限動的方法模擬失重狀態下的低活動度，逐漸發展到采用頭低位的方法模擬失重環境下的血液頭向分布生理學效應[5]。頭低位尾部懸吊模擬失重應激程度較輕，可長時間模擬失重狀態。與其他應激相似，失重可引起人類及動物的下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸功能亢進，可能因此出現抑郁狀態。該模型的研究可為航天特因環境下，抑郁行為機理研究、防護和藥物研究提供實驗基礎。

參考文獻：

[1] Li S, Wang C, Wang MW, et al. Impairment of the spatial learning andmemory induced by learned helplessness and chronic mild stress[J]. PharmacologyBiochemistry and Behavior, 2006, 83(2):186-193.

[2] McTeague LM, Lang PJ. The anxiety spectrum and the reflex physiologyof defense: from circumscribed fear to broad distress[J]. Depress Anxiety,2012, 29:264-281.

[3] Conrad CD. A critical review of chronic stress effects on spatiallearning and memory[J]. Progr Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiat, 2010,34:742-755.

[4] 韓興龍,雷偉,曲麗娜,李瑩輝,胡士軍,殷為民.空間環境誘導心血管功能失調的細胞學機制研究進展[J].航天醫學與醫學工程,2019,32(05):456-462.

[5] 董麗, 王瓊, 劉新民, 楊思進.地面模擬失重實驗方法概況[J].中國實驗動物學報, 2013, 21(05): 90-94.