抑郁癥c57小鼠慢性社會挫敗應激模型

應激是導致抑郁癥發生的重要原因之一。通常，誘發人類抑郁癥的生理心理發生變化應激源屬于社會性應激[1]。研究表明，長時間的慢性應激刺激后，動物會出現一系列的抑郁樣癥狀包括社會回避行為、快感缺失、行為絕望等，且抗抑郁藥物能逆轉這些改變。本實驗中，結果表明，在造模7天后動物出現明顯的社會回避行為，造模14天模型組出現對焦慮沖突行為，造模21天后動物出現明顯的行為絕望并表現出快感缺失癥狀，造模28天后動物快感缺失癥狀及其顯著。造模28天后，在社會交互實驗、糖水偏愛實驗、新奇抑制攝食實驗、懸尾和強迫游泳實驗中均表現出持續、穩定、最明顯的抑郁樣行為改變，因此建議選擇CSDS造模28天進行藥效學實驗為宜。

目前，抑郁癥的發病機制尚未完全清楚。單胺神經遞質假說是抑郁癥發病機制中最重要的假說之一[2]。該假說認為抑郁癥是由于大腦某些區域單胺類神經遞質水平異常引起的。臨床上應用的大多數一線抗抑郁藥，如三環類抗抑郁藥( TCAs) 、5-羥色胺重攝取抑制劑（SSRI）等，也正是通過抑制突觸前膜單胺類遞質再攝取，升高突觸間隙單胺類神經遞質水平而發揮抗抑郁作用[3]。本實驗中，結果顯示CSDS抑郁模型動物海馬和皮層中5-HT、NE和DA含量顯著降低，表明CSDS抑郁模型的發生機制與單胺類神經遞質有關。

下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是一個重要的內分泌軸參與與抑郁癥的發生發展。研究表明，慢性應激會激活并損傷HPA軸功能從而誘發抑郁癥，下丘腦分泌促腎上腺皮質激素釋放因子，調節腺垂體分泌促腎上腺皮質激素，最終引起CORT分泌過量，進而引起機體損傷[4]。臨床研究表明，抑郁癥患者血漿和腦脊液CORT含量顯著升高[5, 6]。本研究發現，CSDS模型小鼠血清CORT較正常組明顯升高，與文獻報道一致。

海馬神經發生是指神經干細胞增殖分化遷移整合入神經回路中生成具有功能的神經元，整合進入原有海馬神經網絡系統可影響海馬的功能，在抑郁癥的發生發展中起著重要的作用[7-9]。DCX( doublecortin，微管結合蛋白)，是神經元前體細胞標志蛋白，常常用來反映神經發生。成人大腦中，DCX+細胞表達局限于神經發生的兩個腦區和新生未成熟神經元的遷移區，因此可以用來研究新生神經元的分化、遷移，是比較常用的研究神經發生的標志蛋白[10]。本實驗結果表明，CSDS模型組小鼠NueN + DCX標記的陽性細胞明顯降低，表明模型組小鼠海馬區神經元增生受到抑制，提示CSDS能抑制了海馬神經再生與文獻報道一致。

研究表明抑郁癥患者和抑郁癥模型動物海馬中的BDNF表達水平下調 [11]。而多種抗抑郁藥物（如五羥色胺再攝取抑制劑及三環類抗抑郁藥物）均能逆轉BDNF表達的降低同時明顯改善神經元損傷[12, 13]。本實驗結果顯示，與空白組相比CSDS模型組小鼠海馬的BDNF表達水平顯著降低。此外，本實驗中CSDS模型小鼠海馬組織中BDNF信號通路相關蛋白CREB、ERK1/2的磷酸化水平較對照組明顯降低，這與文獻報道結果也是一致的。

綜上所述，慢性社會挫敗28天能后模型小鼠出現快感缺失，社會回避、行為絕望等抑郁樣行為，且其血清皮質酮水平和海馬和前額皮層5-HT、NE、DA 水平顯著降低；海馬神經發生抑制； BDNF及的表達及下游pCREB, p-AKT,和p-CREB的表達水平明顯減少。本研究結果顯示社會挫敗應激28天建立了穩定小鼠抑郁癥動物模型，且模型表現出良好的表觀、結構及預測效度。

不同于其他物理應激模型， CSDS是以動物間的從屬關系為基礎的社會應激方式，是一種心理應激模型。它通過同種動物相同或不同品系個體間的個體斗爭后，引起挫敗動物產生情緒和心理壓力，從而導致其產生抑郁行為，可以很好的模擬人類在生活中遭受社會心理壓力所致的抑郁癥。CSDS具有良好的建構效度、表面效度和預測效度，對于抑郁癥的病理生理研究和抗抑郁藥物篩選有重要意義。

技術難點：慢性社會挫敗應激時動物可能在造模過程中產生物理性傷害，從而影響實驗結果，建議在物理傷口大于一厘米是將該動物進行安樂處死。并篩選合適的攻擊CD-1 小鼠。

參考文獻：

[1] 彭云麗,王雯英,蔣春雷,王云霞.應激誘發抑郁癥的細胞因子機制研究進展[J].生理學報,2013,65(02):229-236

[2] López-Mu?oz F, Alamo C. MonoaminergicNeurotransmission: The History of the Discovery of Antidepressants from 1950sUntil Today[J]. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(14):1563-1586.

[3]Fournier J C, Derubeis R J,Hollon S D, et al. Antidepressant Drug Effects and Depression Severity: APatient-Level Meta-Analysis[J]. Journal of the American Medical Association,2010, 303(1):47-53.

[4] 柴麗,趙博.抑郁癥與HPA軸關系及中藥干預的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(12):268-271.

[5]Yang X H, Song S Q, Xu Y.Resveratrol ameliorates chronic unpredictable mild stress-induceddepression-like behavior: involvement of the HPA axis, inflammatory markers,BDNF, and Wnt/β-catenin pathway in rats[J]. Neuropsychiatric Disease andTreatment, 2017, 13:2727-2736.

[6]Gu L, Liu Y J, Wang Y B, et al.Role for monoaminergic systems in the antidepressant-like effect of ethanolextracts from Hemerocallis citrina[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012,139(3):780–787.

[7]Abehiguchi N, Uchida S,Yamagata H, et al. Hippocampal Sirtuin 1 Signaling Mediates Depression-likeBehavior[J]. Biological Psychiatry, 2016, 80(11):815-826.

[8]Sahay A, Hen R. Adulthippocampal neurogenesis in depression[J]. Nature Neuroscience, 2007,10(9):1110-1115.

[9]Park S C. Neurogenesis andantidepressant action[J]. Cell & Tissue Research, 2019, 377(1):95-106.

[10] Couillard-Despres S, Winner B,Schaubeck S, et al. Doublecortin expression in adult brain reflectneurogenesis[J]. European Journal of Neuroscience, 2005, 21(1):1-14.

[11] Deyama S , Bang E , Kato T , etal. Neurotrophic and Antidepressant Actions of Brain-Derived NeurotrophicFactor Require Vascular Endothelial Growth Factor[J]. Biological Psychiatry,2019, 86(2):143-152.

[12] Duman R S, Aghajanian G K,Sanacora G, et al. Synaptic plasticity and depression: new insights from stressand rapid-acting antidepressants[J]. Nature Medicine, 2016, 22(3):238-249.

[13] Mostert J P, Koch M W, HeeringsM, et al. Therapeutic Potential of Fluoxetine in Neurological Disorders[J]. CNSNeuroscience & Therapeutics, 2008, 14(2):153-164.

實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1材料

（1)試劑：

鹽酸氟西汀片，批號：20190516，常州四藥制藥有限公司。

乙腈（色譜純），美國Merck 公司；

甲醇（色譜純），美國Merck 公司；

甲酸銨（分析純），北京化工廠；

去甲腎上腺素（NE）標準品，中國藥品生物制品檢定所；

5-羥色胺（5-HT）標準品，美國Sigma 公司；

多巴胺（DA）標準品，美國Sigma 公司；

3,4-二羥基芐胺（DHBA）內標，美國Sigma 公司；

異丙醇（分析純） 北京化學試劑公司

無水乙醇（分析純） 北京化學試劑公司

氯仿（分析純） 北京化學試劑公司

甲醛（分析純） 北京化學試劑公司

無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司

二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司

甲苯胺藍染色試劑，武漢谷歌生物科技有限公司

中性樹膠，國藥集團化學試劑有限公司

EDTA抗原修復液, 武漢賽維爾生物科技有限公司

檸檬酸 抗原修復液, 武漢賽維爾生物科技有限公司

Doublecortin antibody (Ab77450)，英國Abcam公司

Anti-NeuN antibody (Ab177487), 英國Abcam公司

Fluorescein isothiocyanate-labelled horseanti-rabbit IgG, 美國Pierce公司

Rhodamine-labelled goat anti-mouse IgG, 美國Pierce公司

PBS緩沖液, 北京中杉金橋生物技術有限公司

Tween-20，美國Amresco公司

Protein Ladder, 賽默飛

BDNF antibody (Ab108319)，英國Abcam公司

Doublecortin antibody (Ab77450)，英國Abcam公司

Anti-NeuN antibody (Ab177487), 英國Abcam公司

CREB antibody (#9197), 美國Cell Signaling Technology (CST)公司

Phospho-CREB antibody (#9198), 美國Cell Signaling Technology (CST)公司

p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody (#9107), 美國Cell Signaling Technology (CST)公司

Phospho- p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody (#4370), 美國Cell Signaling Technology (CST)公司

β-ACTIN antibody (#4967), 美國CellSignaling Technology (CST)公司

HRP-linked goat anti rabbit IgG antibody (#7074), 美國Cell Signaling Technology (CST)公司

HRP-linked goat anti mouse IgG antibody (#7076), 美國Cell Signaling Technology (CST)公司

總蛋白定量測定試劑盒（BCA法）, 南京建成生物工程研究所

小鼠血清皮質酮（CORT）試劑盒，中國南京建成生物工程研究所

（2）儀器：

Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司

AL104電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司

1200型液相色譜系統，美國Agilent公司

Q-Trap5500型質譜分析儀，美國應用生物技術公司

Infinite M1000全波長多功能酶標儀，瑞士Tecan公司

2720型PCR儀 美國ABI公司

system electrophoresis Mupid（Mupid 2plus）電泳槽 日本TAKARA公司

image system(EUV-LDUV)凝膠成像系統 韓國KoreaBiotech公司

centrifuge（MICRO 17TR）離心機 韓國Hanil公司

超凈工作臺 蘇州凈化公司

2.5μl/10μl/100μl/200μl/1000μl移液器 德國Eppendorf公司

Eppendorf epMotion 5070 自動加樣項目合作單位 德國Eppendorf公司

autoclave（LS-B50L）滅菌器 中國江陰濱江公司

Freezer Big（DW-40L262）冰箱 青島海爾公司

mixer vortex（Voltex-Genie2 ）漩渦混合器 美國SI公司

脫水機，武漢俊杰電子有限公司

包埋機，武漢俊杰電子有限公司

病理切片機，上海徠卡儀器有限公司

凍臺，武漢俊杰電子有限公司

組織攤片機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司

烤箱，上海慧泰儀器制造有限公司

載玻片及蓋玻片，江蘇世泰實驗器材有限公司

正置光學顯微鏡，日本尼康

成像系統，日本尼康

2 評價方法

2.1 行為學實驗

1) 社會交互實驗

在最后一次社會挫敗應激刺激的24h內進行社會交互實驗[28]。社會交互實驗設備包括方形白色亞克力塑料測試箱 (40×40×40cm), 穿孔透明亞克力塑料盒（7×10×40 cm）及錄像設備。實驗前將透明塑膠盒置于測試箱一側中央位置。社會交互實驗包括兩個階段分別為沒有交互對象的適應期和有交互對象的檢測期，每個階段150s，兩個階段間隔30s內。在適應期內，將每只測試的C57小鼠背向塑料盒輕輕放入測試箱中央，開始第一階段的檢測，允許其自由探索150 s。適應期結束后立即把檢測小鼠從測試箱中拿出，放回其原來的飼養籠中。然后將一只攻擊鼠放入透明塑料盒里，接著將測試鼠再次背對塑料盒重新放入測試箱中央，開始第二階段，并允許它再次探索150秒。攝像機記錄了C57BL/6小鼠在適應期和檢測期間在交互區（定義為塑料盒周圍寬8cm的U形區域）停留的時間。每次實驗結束后，用75%消毒酒精擦拭測試箱和塑料盒，避免氣味對實驗的影響。

2) 糖水偏愛實驗

糖水偏愛實驗分為訓練期及測試期[29]。訓練期共兩天，所有動物單籠飼養，給予每只小鼠兩瓶液體：一瓶蔗糖糖水 (1%) +一瓶純水，訓練期期間動物自由飲食飲水，期間每個12小時更換水瓶位置，保持實驗環境安靜。訓練期次日9:00 am，將食物和水瓶取出，動物禁食（不禁水）共8 h。下午17:00 pm，進行糖水偏愛實驗測試，每只小鼠自由飲用提前稱好重量的糖水和純水共16h。次日早上9:00 am，取下糖水瓶和純水瓶稱重。根據動物糖水、純水攝入量計算動物的糖水偏愛指數（糖水偏愛指數 = 糖水消耗/總液體消耗 × 100%）。測試結束后，加食加水，所有動物自由飲食飲水。

3) 新奇攝食抑制實驗

在動物禁食(不禁水)24h后進行新奇抑制實驗檢測[30]，檢測前預先在測試箱（方形、黑色）中心放入一顆飼料（保證每次實驗每顆飼料大小相等），然后將小鼠背對飼料放入測試箱的一角即開始實驗，時間檢測時間為5min。保證每次從同一方向將動物放入同一位置。觀察記錄動物自放入籠中至首次攝取食物的時間(即攝食潛伏期)，以動物開始咬食飼料為攝食標準。

4) 小鼠懸尾實驗

將小鼠尾巴距尾尖部約1cm 處纏上膠布，通過與S性小鐵鉤與懸尾箱支架上的傳感器相連,小鼠呈倒懸體位, 其頭部離懸尾箱底面約5cm。總的懸掛時間為6min, 統計小鼠后4min內懸尾累積不動時間（不動狀態即小鼠停止掙扎不動或無任何活動）。

5) 小鼠強迫游泳實驗

將小鼠分別放入水深15cm的小鼠恒溫游泳儀（高20cm，直徑14cm）中，水溫維持在24±1℃。測試總共6min, 前2min適應期結束后，計算機自動記錄小鼠后4min內游泳累積不動時間。

2.2 血清皮質酮水平的測定

以生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定小鼠血清中皮質酮（CORT）含量，按照試劑盒的操作步驟進行，于450nm波長測定吸光度（OD）值，制作標準曲線，其含量單位分別是：pg/mL，ng/L，ng/mL

2.3 小鼠模型單胺類神經遞質的影響

2.3.1 腦組織樣品處理

UFLC-MS/MS檢測前從-80℃冰箱中取出冰凍的海馬組織，稱重，并記錄質量，加入100 μL的超純水，冰浴中超聲勻漿得海馬勻漿液。精密吸取50 μL組織勻漿液，加入100 μL 4℃乙腈（含內標DHBA 5 μg/mL），渦旋混勻后置于-80℃冰箱過夜。次日取出勻漿液于4℃低溫離心（2×104 rpm，30 min），取上清液轉入樣品瓶中進行神經遞質濃度分析。

2.3.2 色譜條件

檢測采用TSK Gel amide 80（2.0mm×150mm，3μm）色譜柱,柱溫35℃，流動相為乙腈-15mM甲酸銨水溶液（pH 5.5）（40:60）,流速0.4 mL/min。

2.3.3 質譜條件

檢測采用美國應用生物技術公司（AB SCIEX）的Q-Trap 5500型質譜分析儀，以電噴霧電離方式進行離子化，以多反應檢測（MRM）模式進行掃描，離子源及其他相關參數優化為：TEM: 500 oC； CAD: Medium； Gas1: 50 psi； Gas2: 70 psi； CUR: 20 psi。

+MRM模式參數為：噴霧電壓5500 V; EP: 10; CXP: 10;

2.3.4 標準液的配制精密稱定5-HT、DA和NE的標準品各2 mg裝入試管中，分別加入80%甲醇（含0.2%甲酸）配制成1 mg/mL的儲備液，放于-80℃冰箱備用。精密稱取DHBA 2mg，用80%甲醇（含0.2%甲酸）配制成1 mg/mL的內標（IS）儲備液，存于-80℃冰箱備用。實驗前，取各儲備液適量，混勻后，以80%甲醇（含0.2%甲酸）稀釋成系列混合標準液，其中5-HT、DA、E、NE和DOPAC的濃度分別為200，100，1，0.2 ng/ml。2.3.5 標準曲線檢測前，吸取各混合標準品溶液各50 μL，加入含內標DHBA （5 μg/mL）的乙腈溶液100 μL，渦旋混勻，然后精密吸取5 μL溶液裝入進樣小瓶（含內襯）放入UFLC-MS/MS進行分析。分別以各神經遞質的濃度作為橫坐標，質峰面積與內標的峰面積比值作為縱坐標，通過軟件進行線性回歸，最后繪制出對應的神經遞質的標準曲線。2.4 SY對CSDS小鼠模型海馬海馬神經發生的影響免疫熒光（Neun+DCX）（1）石蠟包埋切片：將大鼠腦片進行常規石蠟包埋，把切好的腦片置于載玻片上。（2）脫蠟：a.脫蠟：二甲苯或松節油(Ⅰ)作用5～15min→二甲苯或松節油（Ⅱ）作用5～10min。b.清洗：無水乙醇處理1～2min→95%乙醇處理1～2min→80%乙醇處理1～2min→70%乙醇處理1～2min→水洗、蒸餾水洗0.5～2min。（3）抗原修復：EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）倒進修復盒中裝滿后將組織切片小心浸入修復緩沖液中，然后放入微波爐中進行抗原修復15分鐘（中火加熱7～8min→停止加熱7～10min→中低火加熱7～8min，需保證組織切片不能太干。取出組織切片，自然冷卻后用PBS（PH7.4）清洗3次，每次5min。（4）畫圈自發熒光淬滅：組化筆在腦組織周圍畫圈，然后在圈內加入自發熒光淬滅劑（5min～7min），水洗、用流水沖洗（8min～10min）。（5）封閉:在圈內滴加40uL的BSA，室溫條件下，孵育（25min～30min）。（6）抗體反應：小心的在腦切片上滴加一定量的一抗（預先用PBS按一定比例配好）。然后將加好一抗的腦切片平放在濕盒內，放入4°C冰箱中過夜。第二天將玻片從冰箱中取出，吸出一抗后將組織切片放入PBS中洗滌3次，每次5min～10min。小心的再圈內滴加二抗使其覆蓋組織，然后室溫條件下孵育50min，此過程應在避光條件下進行。（7）DAPI復染細胞核：組織切片置于PBS洗滌3次，每次5min。在圈內滴加DAPI染液，室溫條件下，孵育10min，此過程應在避光條件下進行。（8）封片：再次用 PBS洗組織切片（每次5min～10min，洗3次）加入抗熒光淬滅封片劑封片。（9）拍照、觀察。2.5 SY對CSDS小鼠模型BDNF信號通路的影響2.5.1 蛋白抽提預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（cocktail）；12000rpm（4度）離心15min。取上清，進行蛋白定量。2.5.2 蛋白質濃度測定（BCA蛋白質定量試劑盒）按照試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。1. 按照50:1比例配制BCA工作液。2. 完全溶解蛋白標準品，濃度為2mg/ml。3. 加入按照不同濃度的的標準品至20μl。4. 加入等體積配置好的樣本。5. 每個檢測孔分別加入200μl的50:1比例配制而成的工作液，設置溫度37℃，放置30分鐘。6. 將酶標儀調整到562 nm波長處，然后測OD值。7. 通過標準曲線計算出蛋白濃度。4.1.6.3 WB實驗（一）SDS-PAGE電泳1. 配備10％分離凝膠，加入TEMED膠灌膠，并用異丙醇密封。2. 等至膠凝充分凝固后倒去膠上層異丙醇，吸干（吸水紙）。3. 配制濃縮膠（4.8％）后灌膠（加入 TEMED），在上層空間灌入濃縮膠使用梳子插入濃縮膠中。4. 計算樣本品所需量，并與5×loading buffer充分混勻，沸水煮5min后立即速冷。5. 根據蛋白定量的結果，第1孔加入marker蛋白，其它每孔加入20 ul已變性蛋白，進行電泳。在電壓80 V下進行濃縮膠電泳，120V電壓下分離膠電泳。當蛋白marker條帶分開清晰時即終止。（二）轉膜1. 根據蛋白marker指示，分別切膠，CREB，P-CREB，AKT（70-75 KD），pAKT，ERK1/2，P- ERK1/2,β-actin。2. 將NC膜浸濕后與濾紙共同放入轉膜緩沖液中浸透。3. 將濾紙，膜，膠按照順序放好（未觀察到氣泡）。4. 蓋上儀器，接通電源，轉膜300 mA，AKT、pAKT約2 h，CREB、P-CREB、β-actin 約1 h。5. 轉膜后，將膜取出放入TBST中清洗5 min。6. 使用麗春紅染膜測轉膜效率。（三）封閉配制5%脫脂奶粉，將轉膜浸入脫脂奶粉后靜置1.5h。（四）一抗孵育按照說明將一抗按比例稀釋，一抗孵育后放入冰箱調溫度至4度過夜。

（五）二抗孵育次日，洗膜三次后，用TBST稀釋HRP標記的二抗，其中小鼠抗（M）和兔抗（R）稀釋液為1： 5000和1：6000， 稀釋后，將第二抗體與膜一起溫育90分鐘。（六）顯色/曝光采用化學發光檢測（ECL、SuperSignal）采用檢測法，首先將ECL化學發光液與膜共同孵育3分鐘，在吸盡液體后用保鮮膜將膜包裹雜交膜，最后再暗盒內曝

光15 min顯影沖洗。Western blot結果以AKT、pAKT、CREB、pCREB與β-action條帶灰度值的相對比值記錄。3 評價結果① 慢性社會挫敗應激對小鼠行為學的影響 實驗中，社會交互實驗結果顯示CSDS造模7天、14天、21天和28天后模型小鼠在交互區的時間與正常對照組相比顯著減少，動物表現出明顯的社會回避行為；而陽性藥氟西汀給藥14天、21天和28天可以逆轉CSDS引起的社會回避行為。提示CSDS造模7天后動物出現明顯的社會回避行為，氟西汀給藥14天后可改善其社會回避行為。在糖水偏愛實驗中，與空白組相比，CSDS造模7天和14天動物的糖水消耗量并沒有明顯改變，在造模21天和28天時，模型組動物的糖水偏愛指

數為較正常組相比顯著降低；與模型組相比，陽性藥氟西汀給藥21天后可以顯著增加動物糖水偏愛指數，給藥28天極顯著增加動物的糖水偏愛指數。提示，CSDS造模21天和28天可引起動物的快感缺失的抑郁樣癥狀，且氟西汀給藥可逆轉這一抑郁樣行為。新奇攝食抑制實驗結果顯示，與空白組比較，CSDS造模14天、21天和28天后，挫敗小鼠攝食潛伏期顯著增加；與模型組相比，陽性藥氟西汀給藥21天和28天可以顯著減少CSDS引起的攝食潛伏期的增加。提示CSDS造模14天后動物表現出明顯的沖突矛盾的抑郁焦慮樣行為，而氟西汀給藥21天后可改善這種抑郁焦慮行為。懸尾實驗和強迫游泳實驗結果顯示，與空白組比較，CSDS造模21天后，挫敗小鼠在TST和FST中，其均不動時間顯著增加，CSDS造模21天后，模型小鼠在TST和FST中，其不動時間極顯著增加；與模型組相比，陽性藥氟西汀給藥21天和28天可以顯著逆轉CSDS引起小鼠在TST和FST不動時間的改變。提示CSDS造模21天和28天動物表現出明顯的抑郁樣癥狀-行為絕望，而氟西汀給藥

21天和28天可改善這種抑郁樣表現。

4.2.2 慢性社會挫敗應激28天對小鼠血清皮質酮水平的影響

② 慢性社會挫敗應激28天對小鼠腦內單胺類神經遞質和的影響

③ 慢性社會挫敗應激28天對小鼠海馬神經發生的影響

④ 慢性社會挫敗應激28天對小鼠海馬區BDNF-ERK -CREB信號通路的影響

（1）動物：SPF級C57BL/6J小鼠（20~22g），雄性，6-8周齡；SPF級CD1小鼠（35~40g），雄性6-8月齡

（2）材料：定制的透明亞克力隔板

（3）儀器：小鼠恒溫游泳儀（KSQT6），小鼠懸尾儀（KSXS01）(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓練中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研制)

（4）模型誘導方法：

① 篩選CD-1作為攻擊鼠

在社會挫敗應激之前，對雄性120退役CD-1小鼠(18-20周齡)的攻擊行為進行篩選以確保入侵小鼠的受打擊力度。評價CD-1小鼠的攻擊行為有兩個標準: 每只CD1小鼠連續攻擊C57小鼠至少2天，觀察周期為180秒，篩選期為3天;第一次攻擊在60秒以內[15]。最終篩選合格的54只CD-1小鼠選擇作為攻擊鼠在實驗前在挫敗籠子中習慣性喂養兩周。

② 慢性社會挫敗應激

造模開始后每天將C57小鼠作為“入侵者”放入居住有篩選合格的攻擊鼠（CD1小鼠）的飼養籠內，允許它們身體接觸5分鐘[26, 27]。在它們接觸的過程中，C57小鼠會受到CD1小鼠間歇性的攻擊，表現出躲避、恐懼、順從等行為。5分鐘的身體接觸后，立即使用多孔的透明有機亞克力板（厚4mm）將二者隔開飼養于同一飼養籠內共24小時，在這 24小時里C57小鼠與CD1小時無身體接觸，但可以從視覺、嗅覺、聽覺上感知CD1小鼠從而接受對它的心理刺激。24小時后，將C57小鼠取出放入住有另一新的攻擊鼠的飼養籠里重復之前操作，保證每天C57小鼠接受不同的攻擊鼠的應激，應激持續28天。正常組C57小鼠使用同樣的飼養籠，與另一C57小鼠成對飼養，用多孔的透明有機亞克力板將二者隔開，每天更換不同的居住對象且保證無身體接觸。在反復的社會挫敗應激過程中，若挫敗鼠出現傷口超過1厘米的情況下，將小鼠從研究中移除并立即安樂死。本實驗中4周社會挫敗應激造模，之后進行行為學檢測。

抑郁癥是一種慢性、易復發的精神情志障礙性疾病，其典型特征表現為消極沉悶、思維遲緩、快感缺乏、無價值感及罪惡感，嚴重者甚至產生自殺的念頭。據世界衛生組織報道，抑郁癥已成為首要致殘原因，20多年抑郁癥將成為導致疾病負擔的一個重大因素[1, 2]。目前抑郁癥的治療以藥物治療為主。而對于抗抑郁藥物的研究涉及到分子水平、組織、器官和整體動物等多個方面，其中動物與人類在進化上的高度保守性，利用實驗動物在不同層次的行為響應特征與人類相比具有的相似性，而且可以避免直接以人體為對象進行研究產生的極大風險及受到的倫理學制約，抑郁動物模型已成為抗抑郁藥物研發的必要手段[3, 4]。

社會挫敗應激模型是一種社會性心理應激的抑郁模型，以動物間的從屬關系為基礎的社會應激方式，是一種心理應激模型[5]。它通過同種動物相同或不同品系個體間的個體斗爭后，引起挫敗動物產生情緒和心理壓力，從而導致其產生抑郁行為，CSDS具有良好的建構效度、表面效度和預測效度，對于抑郁癥的病理生理研究和抗抑郁藥物篩選有重要意義[6,7]。研究表明，長時間的慢性社會挫敗應激刺激后，動物會出現一系列的抑郁樣癥狀包括社會回避行為、快感缺失、行為絕望等，且抗抑郁藥物能逆轉這些改變[8, 9]。采用社會挫敗應激刺激建立更好地模擬人類抑郁癥的發生方式的抑郁動物模型很有必要。研究表明，進行社會挫敗應激的天數不同，其導致的癥狀也不相同。現有的造模方法和造模時間均沒有統一的標準，因此，本研究在前期實驗研究和文獻調研的基礎上，選用不同造模周期（1天、7天、14天、28天）通過社會交互實驗、糖水偏愛實驗、新奇抑制攝食實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗等行為學評價方法，比較不同社會挫敗造模周期的抑郁行為學改變，以期為抑郁癥的研究提供標準化、操作性強的慢性社會挫敗模型模型。同時，我們選用氟西汀作為陽性藥研究了模型的預測效度。

參考文獻：

[1]Malhi G S, Mann J J. Depression[J]. Lancet, 2018,392(10161):2299-2312.

[2]Mcdonnell C. The burden of depression[J]. Nature,2014, 515(7526):163.

[3]Ito N, Hirose E, Ishida T, et al. Kososan, aKampo medicine, prevents a social avoidance behavior and attenuatesneuroinflammation in socially defeated mice[J]. Journal of Neuroinflammation,2017, 14(1):98.

[4]Hao Y, Ge H, Sun M, Gao Y. Selecting anAppropriate Animal Model of Depression[J]. International Journal of MolecularSciences. 2019, 20(19):4827.

[5]桂舒佳,田紹文,謝明.社會挫敗應激模型的研究進展[J].社區醫學雜志,2015,13(24):81-83.

[6]Golden S A, Covington H E, Berton O, et al. Astandardized protocol for repeated social defeat stress in mice[J]. NatureProtocols, 2011, 6(8):1183-1191.

[7]Frijtag J C V, Reijmers L G J E, Harst J E V D,et al. Defeat followed by individual housing results in long-term impairedreward- and cognition-related behaviours in rats[J]. Behavioural Brain Research,2000, 117(1):137-146.

[8]Jiang B, Wang F, Yang S, et al. SKF83959 ProducesAntidepressant Effects in a Chronic Social Defeat Stress Model of Depressionthrough BDNF-TrkB Pathway[J]. International Journal of Neuropsychopharmacology,2014, 18(6):pyu096.

[9]Jiang N, Lv J W, Wang H X, et al.Antidepressant-like effects of 20(S)-protopanaxadiol in a mouse model ofchronic social defeat stress and the related mechanisms[J]. Phytotherapyresearch, 2019, 33(10):2726-2736.