SARS-CoV-2感染轉基因小鼠模型

目前沒有確證 有效的陽性藥物，本單位用細胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發現 PHD1（藥品代號）可以在細胞水平抑制病毒復制，隨后用小鼠模型進行了藥效學評價。發現藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。

所有涉及的病毒實驗操作全部在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所 ABSL 3 實驗室完成，該實驗室已經具備相關實驗室和福利倫理資質。

1. 動物模型評價方法

本實驗建立的新型冠狀病毒動物模型采用監測臨床癥狀、病毒學和病理學 等方法進行分析和鑒定，確定該動物模型成功建立 。

（1）大體觀察：臨床癥狀觀察包括動物的體重變化一般癥狀觀察（弓背、豎毛、反應度降低等）等。動物感染后主要表現為明顯的體重下降，部分動物豎毛，沒有其他明顯的癥狀。與其他傳染病動物模型類似，體重下降百分比與疾病狀態正相關。

（2） 病毒學監測發現，在肺組織中可以檢測到病毒 RNA 并能分離到活病毒，在組織勻漿中電鏡下可以觀察到病毒顆粒，證實從被感染動物中可以分離到病毒，分別在感染后第3天和第5天檢測到肺組織病毒載量，在病因上成功模擬 COVID 19。

（3）病理學檢測發現，被感染動物的肺組織出現間質性肺炎呈彌漫性中度間質性肺炎改變，可見肺泡隔增寬、炎細胞浸潤，血管周圍炎細胞浸潤，肺泡腔內可見巨噬細胞及少量蛋白滲出，在間質性肺炎和巨噬細胞浸潤方面與臨床一致。

以上三項指標模擬了新型冠狀病毒感染肺炎病人的主要指標 ，證明小鼠模型成立。

2.評價指標體系

根據模型的主要表現，該模型用于研究、疫苗和藥物評價時，與模型對照組相比，主要檢測干預組的三類指標：

（1）體重下降百分比

與模型對照組相比，觀察感染小鼠的體重下降百分比改變情況。

（2）肺組織內病毒載量

與模型對照組相比，檢測感染小鼠第3天和第5天肺組織內病毒載量變化情況。

（3）肺組織病理改變

與模型對照組相比，檢測感染小鼠間質性肺炎的病理學改變情況。

3.實驗結果

3.1臨床表現

hACE2轉基因小鼠感染后一般狀態尚可，部分小鼠出現豎毛。感染后小鼠體重出現下降，感染 5天時平均體重下降百分比達到5%

3.2病毒學檢測

（1）病毒分離

感染第3天和第5天從肺組織分離病毒，勻漿接種Vero細胞，可發生有明顯的細胞病變，在電子顯微鏡下觀察到病毒的特征性結構。而對照組小鼠沒有觀察到任何異常現象。

（2）病毒載量

在小鼠感染后第三天和第五天分別收集主要臟器，用以檢測病毒在小鼠體內的分布情況。 RT PCR 結果顯示，感染后 hACE2 轉基因小鼠，只有在肺臟顯現出病毒明顯存在。 感染3 天后，肺組織中病毒載量可達到 106.5拷貝/ml 感染 5 天后，肺組織中病毒載量可達到 105.0拷貝/ml。

（3）病毒抗原檢測

在小鼠感染后第三天和第五天分別收集主要臟器，用免疫熒光檢查病毒在小鼠體內的分布情況，發現病毒主要分布于肺臟支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞內 。

3.3 病理學檢查

（1）肺部大體病理

與對照組相比，感染小鼠肺臟大體病理表現為，肺臟表面出現局灶性病變損傷，呈暗紅色。

（2）肺部組織病理

用免疫組化觀察了肺組織內病毒抗原分布，發現抗原 分布于支氣管上皮細胞（藍箭頭）、肺泡上皮細胞（黑箭頭）和巨噬細胞（紅箭頭）。

小鼠感染后肺組織呈彌漫性中度間質性肺炎改變，可見肺泡隔增寬、炎細胞浸潤，血管周圍炎細胞浸潤（黑色箭頭），肺泡腔內可見巨噬細胞（藍色箭頭）及少量蛋白（綠色箭頭）滲出

3.4抗體檢測

感染小鼠第14天分離血清，檢測到特異性IgG產生。

1試驗材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國疾控中心譚文杰教授提供，新型冠狀病毒的全基因組序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan /IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得，存放于中國微生物數據中心（登錄號NMDC10013001，基因組登錄號MDC60013002-01）。

1.2 試驗動物

選擇SPF 級6 周至 11月齡各段的ICR 與 C57 BL/ 6J，18-22 g，來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所（IACUC 批準號：BLL20001）

2試驗操作規程

2.1 人 hACE2轉基因小鼠的制備

表達人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 啟動子驅動，經 RT-PCR 和 Western blot 驗證 hACE2 基因在小鼠肺組織內的表達（圖3）[4]。

2.2 病毒傳代

將新型冠狀病毒接種到Vero細胞進行分離和儲存。Vero細胞培養在DMEM（英濰捷基, 美國）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養基中，環境為37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標準的半數細胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）進行分析。

2.3 動物模型的感染方法

（1） 途徑：滴鼻；

（2） 感染劑量：1× 105 TCID50 只；

（3） 感染體積：50 μl 只；

（4） 對照組：等體積 PBS。

2.4 動物模型分析

（1）癥狀觀察：感染后，每天觀察動物一般癥狀，記錄體重。

（2）病毒載量：定時收集各組動物臟器，進行RNA抽提，利用RT-PCR技術，檢測組織中病毒載量。RT-PCR所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細胞分離病毒并觀察細胞病變。

（4）病理學觀察 用新鮮的組織制備冰凍切片，將組織固定在冷凍劑上，肺臟組織（10um）切好后在 100% 丙酮內固定 15 分鐘，之后用 HE染色，鏡下觀察。

（5）免疫熒光染色肺臟切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封閉液室溫封閉 1h，一抗4°C 封閉過夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小時， PBS 洗三遍。用 DAPI 染細胞核觀察新型冠狀病毒在小鼠肺臟上的定位。新型冠狀病毒一抗為病人恢復期血清，羊源抗人二抗用， FITC 標記。

（6）感染后第14天，分離血清，測定特異性IgG。

2.5 數據統計處理方法

所有的數據用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，感染組小鼠和其他對照組小鼠用T 檢驗方法分析差異，顯著性差異用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

新型冠狀病毒肺炎起病以發熱為主要的臨床表現，可合并輕度干咳、乏力、呼吸不暢、腹瀉等癥狀，流涕、咳痰等，咯痰癥狀少見。一半患者在一周后出現呼吸困難，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。部分患者起病癥狀輕微，可無發熱等臨床癥狀，多在1周后恢復。多數患者預后良好，少數患者病情危重，甚至死亡。

從影像學表現來看，早期呈現多發小斑片影及間質改變，以肺外帶明顯。進而發展為雙肺多發磨玻璃影、浸潤影，嚴重者可出現肺實變，胸腔積液少見。

從免疫學表現來看，患者還可出現發病早期外周血白細胞總數正常或減低、淋巴細胞計數減少，部分患者出現肝酶、肌酶和肌紅蛋白增高。多數患者C反應蛋白和血沉升高，降鈣素原正常。嚴重者D-D二聚體升高，淋巴細胞進行性減少。

從組織病理學表現來看，患者表現為間質性肺炎，肺泡腔大量的多核巨細胞和巨噬細胞浸潤，肺泡比彌漫性增厚，肺泡間隔增寬。

2. 研究目的和意義

利用SARS-CoV-2感染表達人SARS-CoV受體ACE2的轉基因小鼠，觀察并檢測感染后的臨床癥狀、病原學和病理學等指標，獲得SARS-CoV-2感染引起肺炎發生、發展的動態數據，構建轉基因小鼠模型，滿足致病機制、疫苗和藥物評價、傳播途徑等研究對動物模型的需求。

3. 國內外研究現狀

2019年底，在中國湖北武漢華南海鮮市場爆發的新型冠狀病毒感染肺炎（COVID-19）疫情[1]，已經波及全中國及其他許多國家，被世界衛生組織定義為“國際關注的突發公共衛生事件”[2]。當務之急是要找到預防和治療新型冠狀病毒的有效措施，因此，研究新型冠狀病毒在體內的致病機制迫在眉睫。構建新型冠狀病毒肺炎的動物模型，不但為了解該疾病的致病性和病理損傷特征打下基礎，也是評價相關藥物和疫苗的有效性和安全性時，不可或缺的工具和科技支撐。

因為新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）和嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高度的同源性，而SARS病毒進入人體的特異性受體為人血管緊張素轉化酶2（human Angiotensin-converting enzyme 2，hACE2）[3]。科研人員經過大量的分子生物學分析表明，新型冠狀病毒很有可能利用同樣的受體hACE2入侵人體。因此，我們選擇hACE2轉基因小鼠作為感染新型冠狀病毒的模型動物，用以構建SARS-CoV-2感染小鼠模型。