慢性不可預測應激誘導老鼠學習記憶障礙模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預測，可誘導性是模型制造成功的關鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經生物學機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發的焦慮、學習記憶障礙及防護藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學結果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機制進行了基礎研究，認為CUMS模型會導致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認為采用慢性不可預測應激，35天可以造成大鼠和小鼠學習記憶障礙。

模型技術難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗模型的成功與否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，以避免動物產生適應性。相同的刺激因子應該隔3-7日再進行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預測應激模型，通過水迷宮、避暗等經典行為學指標，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質基礎機制指標，表明了慢性不可預測應激誘導老鼠學習記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進一步的改善學習記憶藥物的藥效學評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1 實驗材料

（1）藥品與試劑：

標準物質多巴胺（DA）、乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）來自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美國莫州）。 （2）儀器： ① 行為學檢測：水迷宮儀器 ② 機制檢測：全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）、超聲細胞破碎儀（美國Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。2 評價方法 （1） 行為學評價: ① 大鼠水迷宮實驗 水迷宮實驗（Morris Water Maze test, MWM test）采用大鼠水迷宮計算機圖像實時檢測分析處理系統進行。大鼠水迷宮為直徑180cm，高60cm 圓形的水池。在水池壁上標明4 個點，并據此將水池分為四個象限，于其中一象限中心置一直徑為10cm，高30cm 的鐵質圓形平臺，水面高于平臺1cm，水溫控制在(25±2)℃。水迷宮測試分為兩個階段，即①定位航行實驗，歷時5 天，每只動物每天3 個象限（實臺象限除外），將大鼠面向池壁放入水中，記錄1.5 min 內尋找平臺所需時間(尋臺潛伏期)。若大鼠入水后1.5 min 內未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留30s，尋臺潛伏期記錄為1.5 min。② 空間探索實驗，定位航行實驗結束后撤除平臺，將大鼠面向水壁從對角象限入水放入池內，記錄1.5 min 內，動物在實臺象限的游程、時間等指標。

② 小鼠避暗實驗

避暗實驗前一天，將動物頭部背向電動門自明室放入，任其在明暗室內自由活動以熟悉環境。5 min 后，取出，放回原籠。實驗分為記憶獲得和鞏固兩個階段，均于給藥1 小時后開始檢測。記憶獲得階段：將動物頭部背向電動門自暗室放入，暗室電壓幅度為39v。檢測時間為5 min。軟件自動記錄5 min內錯誤次數、暗室時間及暗室路程。24 小時后，進行記憶鞏固實驗：將動物頭部背向電動門自明室放入，即開始實驗，電壓幅度為39 v。軟件自動記錄5 min 內錯誤次數、入暗潛伏期、暗室時間及暗室路程。

③皮毛狀態測試

皮毛狀態測試在實驗前及應激刺激結束后各測試一次。皮毛狀態測試部位包括頭、頸、背部、腹部、前后爪、尾巴、生殖器七個部位。皮毛整潔，計0分，皮毛臟亂，計1分。皮毛狀態指數=計分總數/部位數。

2 機制的檢測

①CUMS對大鼠神經遞質檢測

采用實驗室前期的實驗方法-LC-MS/MS進行測定。

色譜條件：色譜柱為 TSK-GEL Amide-80，柱溫35 ℃；以乙腈–水 (含6 mM HCOONH4)（67.5 : 32.5）為流動相，0.2 mL/min 流速。

質譜條件：ESI 離子源；正離子模式檢測；電噴霧電壓為4500V；信號采集方式為多反應檢測（MRM）；GS1：50 psi；GS2：50 psi；TEM：450℃。

標準溶液的配制：精密稱取標準品 DA， NE，5-HT，Ach，GABA，Glu，DHBA 各 1 mg，用含0.2% 甲酸的甲醇：水(1：1)配制成 1 mg/mL 的儲備液（-80℃保存），臨用前分別吸取各神經遞質的標準儲備液20 μL，加入860 μL 含 0.2% 甲酸的甲醇水（1:1），配制成20 μg/mL 的混合標準液，渦旋混勻，然后分別稀釋至1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2，0.1 ng/mL 的系列混合標準液，稀釋后每200 μL混合標準液中加入300 μg/ml 的內標溶液20 μL。標準溶液均在臨用前配制。

測定方法：組織稱重，向EP 管中加入200 μl 純水。用超聲破碎儀進行勻漿，后加入400 μL含0.2%甲酸乙腈，放于-20℃冰箱內過夜。次日從冰箱內取出樣品，在4℃離心12000r/min，10min，各取上清液200 μL，加內標20μL(300μg/mL DHBA)，將樣品50μl 注入LC-MS/MS 進行分析。

②CUMS對小鼠神經遞質檢測

方法同大鼠。

統計分析

實驗結果采用SPSS 22. 0 統計軟件進行統計學分析，結果以均值±標準誤（Mean ± SEM）形式表示。采用one-way ANOVA 進行組內比較，使用最小顯著差數法（LSD）多重比較方法比較兩組間差異，當P <0.05則認為差異具有統計學意義。

3. 結果

（1）CUMS對大鼠的影響

① CUMS對大鼠體重的影響

CUMS 模型組大鼠在應激發生第2、3、4、5 周后體重較正常組明顯下降（P<0.01）。西酞普蘭組未能逆轉應激因素導致的體重下降。

② CUMS對大鼠水迷宮的影響

前5天的定位航行中，CUMS大鼠從第二天起尋臺潛伏期比正常大鼠長（P<0.05）。在第六天的空間探索實驗中CUMS大鼠與正常大鼠相比，跨平臺位置次數明顯減少（P<0.05）。

（2）CUMS對小鼠的影響

①CUMS對小鼠體重的影響

隨著應激時間的延長，CUMS模型組體重增加緩慢，第5周時，模型組體重明顯下降，與正常組相比，具有顯著性差異。

③ CUMS對小鼠避暗實驗的影響

結果顯示，避暗實驗記憶鞏固階段，CUMS模型小鼠入暗次數及在暗室中的時間和路程均明顯增加，與正常組相比，具有顯著性差異（P<0.01）。圖3 CUMS模型對小鼠避暗實驗的影響（mean±SEM ，n=12，**p<0.01，與正常組比較） （3）機制檢測結果 ① CUMS對大鼠前額皮層組織神經遞質的影響

CUMS 模型組前額皮層5-HT含量較正常組明顯下降（P<0.01），模型組前額皮層NE含量較正常組明顯下降（P<0.05）

1 動物：雄性Wistar 大鼠，180-220 g，SPF 級。分為空白對照組、CUMS模型組，每組10只。 雄性 BALB/c 小鼠，26-28 g，SPF 級，分為空白對照組、CUMS模型組，每組12只。

2 模型誘導方法：

（1）大鼠慢性不可預測性應激模型的建立

在本課題組前期CUMS應激方法的基礎上進行改進。除正常對照組外，其余大鼠每日隨機接受各種不同的應激源的刺激，包括：應激因素包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、強迫游泳（25℃，20 min 或10 ℃，5 min）、噪聲3 小時、行為限制（使用自行研發的大鼠行為限制器，長20cm, 直徑7 cm），配對飼養、濕籠、傾籠等。應激時間為5 周，每日2-3 種，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，避免動物產生適應性。末次給藥后進行相關行為學檢測，并取腦組織進行相關檢測。模型組單籠飼養，正常組大鼠群養，每籠5 只，并放置另外房間飼養。

（2）小鼠慢性不可預測性應激模型的建立

應激因素包括：禁食、禁水、強迫游泳，配對飼養、濕籠、傾籠、晝夜顛倒等。應激時間為5 周，每日2-3 種，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，避免動物產生適應性。具體刺激時間同大鼠（表1）

Katz[1]等在20世紀80年代早期開始慢性應激模型的研究，連續三周給予動物一系列高強度刺激因素如電擊、冰水游泳等，動物呈現抑郁狀態。Willner[2]等在此基礎上，降低了應激刺激的強度，延長應激時間，并將快感缺失測試作為該模型的主要評價方法，形成了慢性不可預測性溫和應激模型（CUMS）。應激因子包括晝夜節律的調整和光照性質的改變( 閃光、間斷光照)、食物和飲水的調整、環境的改變( 鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊足底、游泳等。應激因子的多變性和不可預測性是模型制造成功的關鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經生物學機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發的焦慮、學習記憶障礙及防護藥物研究。研究發現，CUMS能夠造成小鼠空間學習記憶障礙[3]。

因此，本研究聚焦于CUMS對老鼠學習記憶的影響，采用Morris 水迷宮檢測慢性應激對大鼠依賴性空間學習記憶能力的影響；采用避暗行為學檢測慢性應激對小鼠記憶的獲得、鞏固、再現等過程。慢性應激對于Morris 水迷宮的影響，研究報道不盡一致。有研究發現慢性應激可損傷大鼠的空間學習記憶功能[4]。有報道認為，慢性應激可促進動物在Morris 水迷宮測試中的學習記憶功能[5]。本研究采用Morris 水迷宮檢測慢性應激對大鼠空間學習記憶能力的影響。避暗實驗是利用嚙齒類動物趨暗避明的習性設計，動物進入暗室即遭足底電擊，反復數次后形成條件反射[6]。這種厭惡性條件反射形成快且恐懼記憶持續時間長，是較為敏感的學習記憶評價方法。本研究利用避暗實驗評價CUMS 小鼠模型的認知功能損傷。

目前，文獻報道的CUMS刺激因子刺激因子的多變性、不可預見性是模型成功的關鍵，單獨使用一種刺激不能產生理想的效果，每種刺激因子應間隔3～7 d[7]，大部分CUMS造模過程都選擇了7-11種刺激因子，只有少數實驗選擇了≥12或≤6種的刺激因子，最少的用了4種，最多的用了14種。造模周期有2-8周不等，其中以3-6周最為常見。本模型選用適宜的造模時間-35天，以及常用的幾種刺激因子，確定該模型誘導的認知障礙模型為現代人類長期處于慢性不可預測應激作用下誘發的學習記憶減退機理研究、防護和藥物研究提供實驗模型。

參考文獻：

[1] KATZ R.Animal model of depression: pharmacological sensitivity of a hedonic deficit[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1982, 16(6): 965-8.

[2] WILLNER P.Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model ofdepression: a 10-year review and evaluation [J]. Psychopharmacology (Berl),1997, 134(4): 319-29.

[3] 瞿禮萍, 曾南, 梁珂, 等. 逍遙散對慢性溫和應激模型小鼠行為學及空間學習記憶能力的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2007,23(5):18-21.

[4] CUADRADO-TEJEDOR M, RICOBARAZA A,DEL RIO J, et al. Chronic mild stress in mice promotes cognitive impairment andCDK5-dependent tau hyperphosphorylation [J]. Behav Brain Res, 2011, 220(2): 338-43.

[5] GOUIRAND A M, MATUSZEWICH L. Theeffects of chronic unpredictable stress on male rats in the water maze [J].Physiology & Behavior, 2005, 86(1-2): 21-31.

[6] SHULZ D,CHERNICHOVSKY D, ALLWEIS C. A novel method for quantifying passive-avoidance behaviorbased on the exponential distribution of step-through latencies [J]. PharmacolBiochem Behav, 1986, 25(5): 979-83.

[7] Willner P．Chronic mildstress ( CMS) revisited: Consistency and behavioural-neurobiologicalconcordance in the effects of CMS[J]. Neuropsychobiology，2005, 52(2) :90-110．