顳葉癲癇食蟹猴海人酸模型

在第3次和第4次KA誘導后的前兩天的監控錄像中我們觀察到，食蟹獼猴表現出由左側前肢開始的自發性痙攣，接著是直立和平衡喪失，每天跌倒約5~10次。但是在慢性期沒有觀察到這樣的現象。

在食蟹獼猴最后一次接受KA注射后的三個月里，連續4周以每周一次的頻率記錄持續60分鐘的EEG腦電。如圖所示，在的腦電結果中我們觀察到了大量位于顳葉棘波（15~90次/30 min）。95%的棘波出現在右側顳葉，在左側顳葉也檢測到同步的棘波。

EEG腦電顯示，每次發作會有持續10~15秒的高頻同步放電活動，猴子也表現出凝視和刻板樣行為。隨后，猴子出現緩慢轉頭和舔唇動作。在慢性癲癇階段的EEG腦電圖記錄中，我們沒有監測到全身性陣攣性發作或運動癥狀。這種表現與顳葉癲癇的臨床表現一致，因為在顳葉癲癇患者中也很少出現全身性陣攣性發作。

為了評估顳葉癲癇模型的建模效果，我們對處于慢性癲癇期的猴子進行了長期連續的視頻記錄。與預期一致，在注射KA后的 3~6個月，在任何猴子身上都沒有發現明顯的驚厥發作。這與之前的報道一致，該研究發現在自發性癲癇的慢性階段，接受顳葉癲癇造模處理的獼猴沒有表現出明顯的驚厥發作。

創新性

以往的非人靈長類顳葉癲癇模型均為恒河猴模型，食蟹猴相比于恒河猴具有體積小、便于實驗操作的優點。

動物模型的制備和應用實驗在具備相應資質的實驗室開展。動物模型的制備、應用過程中的監督管理、處置措施、對環境和生態影響等應符合國家相關法律規定。

1. KA注射后誘導急性癲癇發作

KA注射后約30 min，食蟹猴開始從麻醉中蘇醒，開始出現分泌唾液，呼吸加快，單個肢體不自主抽搐進而演變成雙側肢體不自主抽搐，全身性強直-陣攣性抽搐。發作約60 min后在沒有抗癲癇治療的情況下恢復正常。

2. 病理驗證

如果對急性癲癇發作后死亡的食蟹猴進行大腦病理解剖，經過蘇木素染色后的病理結果顯示，注射位點位于海馬齒狀回區域，海馬CA3區域錐體神經元發生神經元核固縮，存在大量死亡的現象。

3. KA注射前后的腦電記錄驗證（圖示見“有助于動物模型鑒定和評價的其它材料”）

注射前腦電以慢波（θ波）為主，無明顯尖波和棘波（圖 2A）。

急性期癲癇樣尖波首先在注射側顳葉出現，隨后擴散至前額葉（圖 2B）。腦電記錄中可觀察到5-9Hz高波幅節律性癲癇樣尖波。約10min后食蟹猴進入狀態性癲癇發作，腦電中觀察到雙側對稱爆發性10-14 Hz節律性尖波（圖 2D）以及出現肌電干擾（圖 2C），食蟹猴表現出肢體顫動。狀態性癲癇發作過程維持約60 min。注射生理鹽水組食蟹猴在注射前后腦電信號沒有顯著變化。

4. KA注射3個月后的腦電驗證（圖示見“有助于動物模型鑒定和評價的其它材料”）

該模型在KA注射后具有自發性的癲癇異常放電。在KA注射后3個月，麻醉后通過腦電記錄，可檢測到整個大腦的尖波異常放電。證實模型建立成果，具有癲癇發作慢性期的自發性異常尖波放電。如果沒有檢測到慢性期的異常腦電，說明建模不成功，原因可能是KA誘導的急性癲癇發作程度不夠，導致初始的海馬損傷不夠強烈。

5. 公開發表的論文依據

本模型建立的相關工作發表于國際研究期刊：Chen T, et al. A cynomolgus monkey model of temporal lobe epilepsy.Brain Research Bulletin, 2019, 144(187-193).

實驗材料

8-10歲食蟹猴雌性四只，雄性2只，4ug/ul/kg KA工作液，3%的戊巴比妥鈉溶液，3% H2O2，75%醫用酒精，醫用消毒脫脂棉，醫用消毒棉簽，手術器械，手術縫合線，非人靈長類動物立體定位注射儀，醫用小動物打孔器，電動理發機，一次性醫用注射器，微量注射玻璃針，非人靈長類動物固定架。

實驗環境

屏障環境，非人靈長類實驗動物專用手術間。

實驗方法

1. 食蟹猴麻醉，一次性醫用注射器靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液（1 kg/ml），食蟹猴深度麻醉后（顳子輕輕夾腳趾無反應，呼吸均勻）轉移到非人靈長類動物立體定位注射儀上，固定頭部。

2. 食蟹猴轉移到非人靈長類實驗動物專用手術間，食蟹猴和手術人員全身消毒。

3. 用電動理發機剪剪去食蟹猴頭部毛發，暴露頭皮，75%醫用酒精和碘伏依次消毒皮膚3遍，用消毒后的手術刀切開右側頂骨皮膚，位于海馬正上方，切口長度約10 mm，暴露顱骨。

4. 用醫用棉簽蘸取3% H2O2，輕輕擦拭顱骨表面組織；醫用棉簽蘸取75%醫用酒精擦去殘留的H2O2，醫用棉簽擦凈顱骨表面。

5. 牙科打孔器打出直徑約1 mm的孔洞，到硬腦膜止。

6. 用立體定位方法定向單側海馬CA區注射海人酸（kainic acid，KA）。注射位點為食蟹獼猴右側海馬，坐標：以右側耳蝸與中縫連線的交點為原點，向前10 mm，再向右10 mm，深度為硬腦膜下35 mm。單次KA注射量4μg/μl/kg，注射后停針10分鐘。

7. 注射完畢后，收回注射針，縫合線縫合食蟹猴頭頂傷口，消毒傷口附近皮膚。將注射結束后的食蟹猴轉移到溫暖安靜的檢測室中，使用非人靈長類動物固定架固定食蟹猴的四肢和頭部，卡槽留有縫隙食蟹獼猴頭部可以輕微轉動，接下來準備腦電記錄。

8. 食蟹猴腦電記錄選用Open-BCI 無線腦電記錄模塊。腦電記錄前使用75%酒精擦拭食蟹獼猴頭部皮膚，以去除毛發碎屑以及油脂。采用頭皮電極和對食蟹猴顳葉進行腦電記錄。頭皮電極使用方法：將涂抹導電膏的杯狀電極別貼附于雙側額葉（P3/P4）、雙側顳葉（F3/F4），以枕葉中縫（Cz）作為參考，右前肢食指接地。為了排除心電干擾，于心前區放置一個盤狀電極記錄心電圖。為了排除心電干擾，心前區放置一個盤狀電極記錄心電圖。EEG采集過程中，參數分別設置為靈敏度30 μV/mm，時間常數0.3 S，濾波范圍0.5~50 Hz，采樣頻率250 Hz。

9. 腦電記錄結束后將食蟹猴放在舒適恒溫的環境中使其自然蘇醒，在此過程中密切觀察食蟹猴的呼吸和體溫，如食蟹猴有表現出不適應立即聯系獸醫，食蟹猴蘇醒后放回原來的籠位，及時補充食物和飲水。

10. 本研究中，每只食蟹獼猴接受3~4次KA誘導，每周一次。

研究目的及意義

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，據估計，全世界范圍內約有5000萬癲癇患者，每年的癲癇發生率約為240萬。我國目前約有900萬的癲癇患者，約占全世界癲癇患者總數的1/5.

部分性癲癇患者約占癲癇患者總數的60%，部分性癲癇是指癲癇的病灶位于大腦半球中的一個或者位于一側大腦半球的局部區域內。顳葉癲癇是部分性癲癇的常見類型。顳葉癲癇患者中約有1/3的患者對于常見的抗癲癇藥物治療無效，這使得顳葉癲癇成了成人最難治療的癲癇類型。對于這些患者，手術切除治療是唯一的治療選擇。顳葉癲癇手術治療前需要準確定位致癲組織，手術切除時更需要完整切除致癲灶。但是由于致癲組織切除不足，仍有30%左右患者出現癲癇復發。對于無法準確定位致癲組織的癲癇患者來說，手術切除并不適合他們。

非人靈長類（non-human primates, NHPs）是指除了人類以外，其他所有靈長類動物的總稱，包括11科51屬，近400種動物。NHPs可分為新世界猴和舊世界猴。新世界猴包括狨猴屬（Marmosets）的普通狨猴（common Marmosets）等，具有對結核病存在抵抗力，不易攜帶B病毒，無頰囊等特點。舊世界猴包括彌猴屬（macaque）的食蟹獼猴（Macaca fascicularis）和恒河猴（rhesusmacaque）等，其特點是對結核桿菌敏感，易攜帶B病毒，存在大頰囊。

嚙齒類實驗動物在遺傳上只有84%基因序列與人類相同，其生理功能和解剖結構與人類存在巨大差異，不能嚴格地預測藥物的療效或對人類的潛在毒性。而NHPs有超過98%基因序列與人類相同，其脾，外周血單核細胞，肝的基因組轉錄水平與人類的相似度分別達到了91.41%，84.36%和74.29%。這種遺傳水平和生理代謝上的高度接近使NHPs成為人類疾病研究的理想模型，特別在重性腦疾病，心血管疾病和疫苗研發等重點研究領域 。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的環狀類似物以及離子型KA受體激動劑，最早從海藻中提取，當作殺蟲劑使用。KA處理神經元可以誘導強烈的去極化作用最終導致神經元的死亡，這也是顳葉癲癇主要的病理表現。KA處理的嚙齒類動物最開始具有急性期癲癇發作，隨后進入4-5周的潛伏期，最終進入難治性的自發性癲癇發作階段。KA處理的嚙齒類動物會有海馬硬化相關的病理表現，包括海馬神經元丟失，顆粒細胞散布，苔狀纖維發芽等，這與顳葉癲癇患者的病理表現接近。

使用顳葉癲癇非人靈長類海人酸模型可以更好地模擬顳葉癲癇患者地臨床表現，為顳葉癲癇發病機制的研究以及抗顳葉癲癇藥物的研發提供幫助。

國內外研究進展

Chen等人通過定向海馬注射KA方法成功建立顳葉癲癇恒河猴模型，研究觀察到了急性期的癲癇樣放電，包括肢體抽搐，流涎等典型癲癇癥狀，但是在慢性期監測中沒有觀察到亞臨床癲癇發作。Perez等人報道通過全身給藥的方式注射匹羅卡品誘導的mTLE狨猴模型，在此模型的慢性期腦電中監測中不僅檢測到了亞臨床癲癇樣放電還觀察到了自發性癲癇發作，但是沒有觀察到癲癇間期放電的特征圖。相比于恒河猴，食蟹猴體積小，性格溫順，容易獲得，因此食蟹猴在人類疾病模型研究操作起來更加方便。