慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠抑郁模型

生活性應(yīng)激源暴露是臨床抑郁癥的重要誘發(fā)因素。臨床研究表明，長(zhǎng)期暴露于不可控、不可預(yù)見(jiàn)的生活事件的人更容易催患抑郁障礙。CUMS 動(dòng)物模型讓動(dòng)物經(jīng)歷多種慢性不可預(yù)知、低強(qiáng)度刺激，與人類抑郁癥誘因相似，其病因和病理機(jī)制接近于人類抑郁癥，是經(jīng)典抑郁癥動(dòng)物模型，廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物作用的研究。20 世紀(jì)80 年代早期，Katz 開(kāi)始了對(duì)慢性應(yīng)激模型的研究，即給予動(dòng)物一系列高強(qiáng)度刺激因素(電擊、噪聲、長(zhǎng)時(shí)間行為限制等)，連續(xù)三周，動(dòng)物表現(xiàn)出抑郁樣狀態(tài)。Willner在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，降低了應(yīng)激刺激的強(qiáng)度，延長(zhǎng)應(yīng)激時(shí)間，并將快感缺乏的測(cè)試作為CUMS 的主要評(píng)價(jià)方法，建立了CUMS 動(dòng)物模型。該模型主要模擬了人類抑郁的核心癥狀：快感缺乏，同時(shí)也模擬了中重度抑郁癥的其他表現(xiàn)，如社會(huì)交往能力下降，探索行為能力下降等。

本研究中，通過(guò)糖水偏愛(ài)你實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳結(jié)果可以看CUMS模型組大鼠糖水偏愛(ài)指數(shù)下降、新奇攝食抑制實(shí)驗(yàn)潛伏期延長(zhǎng)、懸尾及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，與正常組相比，具有顯著性差異，而經(jīng)典的抗抑郁藥氟西汀給藥可以逆轉(zhuǎn)這些抑郁樣行為。提示大鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對(duì)CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物皮層和海馬組織的5-HT和DA神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低，血清皮質(zhì)酮含量顯著升高，海馬BDNF水平顯著降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激，35天可以造成大鼠抑郁樣行為，并且經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)條件對(duì)于小鼠同樣適用。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對(duì)于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動(dòng)物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長(zhǎng)20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對(duì)飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，以避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過(guò)不同的刺激因子對(duì)大鼠造成慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激模型，通過(guò)糖水偏愛(ài)、新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)、懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及神經(jīng)遞質(zhì)、皮質(zhì)酮和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠抑郁模型的成功，并且該模型對(duì)于BALB/c 小鼠等同樣適用，本模型可用于進(jìn)一步的抗抑郁藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級(jí)大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過(guò)除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無(wú)異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）藥品與試劑：

鹽酸氟西汀片，批號(hào)：20190516，常州四藥制藥有限公司。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）來(lái)自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美國(guó)莫州）。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定BDNF、CORT試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所（南京，中國(guó)）。

（2）儀器：

① 行為學(xué)檢測(cè)：糖水偏愛(ài)、新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)、大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)、大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

② 機(jī)制檢測(cè)：全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評(píng)價(jià)方法

（1） 行為學(xué)評(píng)價(jià):

① 糖水偏愛(ài)：

分為訓(xùn)練期和測(cè)試期。訓(xùn)練期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)共需3d，第一個(gè)24h，大鼠飲水瓶為兩瓶均裝有1%蔗糖水各100ml；第二個(gè)24h，大鼠飲水瓶為一個(gè)瓶裝有1%蔗糖水100ml，一個(gè)瓶裝純凈水100ml；再經(jīng)過(guò)24h的禁食禁水后，進(jìn)行動(dòng)物的基礎(chǔ)糖水/純水消耗實(shí)驗(yàn)：同時(shí)給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水100ml，一瓶純水100ml，1h后，取走兩瓶并稱重，計(jì)算動(dòng)物的總液體消耗，糖水消耗，純水消耗，糖水偏好指數(shù)。為避免位置偏愛(ài)影響因素，測(cè)試中間，將兩瓶位置互換。造模前，進(jìn)行糖水偏好訓(xùn)練及基線測(cè)試，根據(jù)測(cè)試結(jié)果，將動(dòng)物分組。造模結(jié)束后，再進(jìn)行一次糖水偏愛(ài)測(cè)試，以評(píng)價(jià)動(dòng)物快感缺失的癥狀。

② 新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)

采用圓形敞箱（直徑90cm，高60cm），每次檢測(cè)前再測(cè)試箱中心放3粒同等大小的食丸。大鼠在禁食禁水24小時(shí)后，面向測(cè)試箱壁沿著箱壁放入敞箱中，每次從同一方向、同一位置放入，記錄15 min內(nèi)第一次攝食潛伏期（以大鼠第一次咬食食丸為標(biāo)準(zhǔn)），即動(dòng)物自放入測(cè)試箱中至首次攝取食物的時(shí)間。（2）皮質(zhì)酮含量的測(cè)定

③ 大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)

于距大鼠尾尖部用膠布纏上掛于支架上, 使大鼠成倒掛狀態(tài), 其頭部離箱底約5cm。懸掛時(shí)間為6min, 統(tǒng)計(jì)大鼠后4min內(nèi)懸尾累積不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)狀態(tài)即大鼠停止掙扎不動(dòng)或無(wú)任何活動(dòng)）。

④ 大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)方法分為訓(xùn)練期和測(cè)試期，大鼠放入裝有30cm水的透明亞克力塑料圓桶內(nèi)（直徑18cm，高40cm）, 水溫維持在24 ± 1°C，連續(xù)兩天游泳。第一天使其預(yù)游泳（預(yù)適應(yīng)）15min。24h后進(jìn)入測(cè)試期，將大鼠放入桶中，記錄5min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)即大鼠停止掙扎，呈漂浮直立狀態(tài)，僅有偶爾的肢體運(yùn)動(dòng)以及保持頭部浮在水面的持續(xù)時(shí)間）。

⑤ 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

采用實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)方法-LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：色譜柱 2.0 mm×150 mm，3 μm（TSK Gel amide 80，TOSOH公司）；流動(dòng)相：乙腈-15 mM甲酸銨水溶液（pH 5.5）（40:60）；柱溫：35 ℃；樣品室溫：4 ℃；流速：0.4 ml/min。

質(zhì)譜條件：以電噴霧電離方式進(jìn)行離子化，以多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式進(jìn)行掃描，離子源及其他相關(guān)參數(shù)優(yōu)化為：TEM: 500 ℃; CAD: Medium; Gas1: 50 psi; Gas2: 70 psi; CUR: 20psi。+MRM模式參數(shù)為：噴霧電壓5500 V; EP: 10; CXP: 10；-MRM模式參數(shù)為：噴霧電壓-4500 V; EP: -10; CXP: -13；

1 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，30只，雄性，體重180-220g。分為空白對(duì)照組、CUMS模型組、陽(yáng)性藥組。

2 模型誘導(dǎo)方法：

慢性不可預(yù)測(cè)性應(yīng)激模型的建立

在本課題組前期CUMS應(yīng)激方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。除正常對(duì)照組外，其余大鼠每日隨機(jī)接受各種不同的應(yīng)激源的刺激，包括：束縛 6h、濕籠 12 h、冰水游泳（4°C）5min、熱水游泳（42°C）5min，頻閃12h、45度斜籠7 h、夾尾3min, 噪音24 h、電擊10 min、晝夜顛倒、持續(xù)光照36h、禁食禁水24h、冰水游等刺激，每天隨機(jī)安排，同一種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不能預(yù)見(jiàn)給予的刺激，每日1～2種。造模時(shí)間持續(xù)35d。從造模開(kāi)始各組分別灌胃給予相應(yīng)藥液，給藥期間各組繼續(xù)造模，連續(xù)給藥35d，末次給藥后進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)檢測(cè)，并取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

時(shí)間-造模方式-具體安排

星期一

冰水游泳10min+頻閃12h+噪音30min

8:50am-9:00am 冰水游泳

9:00-9:30am噪音

9:00am-9:00pm頻閃

星期二

禁水12h+濕籠12h

9:00pm-9:00am濕籠

星期三

電擊5min+晝夜顛倒

9:00am-9:30am 電擊

星期四

熱水游泳10min+頻閃12h+噪音30min

8:50am-9:00am熱水游泳

9:00-9:30am噪音

星期五

禁食12h+間斷照明30min

9:30am-9:30pm束縛

9:30pm-9:30am傾籠

星期六

夾尾3min +頻閃12h+噪音30min

9:00-9:30am噪音

9:00am-9:00am頻閃

星期日

束縛6h+傾籠12h

8:30am-8:30pm禁食；9:00am-9:00pm間斷照明

抑郁癥是一種嚴(yán)重影響人體健康的精神疾病，其患病率約占總?cè)丝诘?% [1]。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)到2020 年抑郁癥將成為第二大主要疾病之一，給社會(huì)帶來(lái)極大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]，抑郁癥已成為全世界共同面臨的衛(wèi)生健康難題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性生活事件是抑郁癥的顯著促發(fā)因素[3]，引發(fā)抑郁的主要原因是來(lái)自慢性、低強(qiáng)度、長(zhǎng)期的日常壓力。

文獻(xiàn)中關(guān)于建立該模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress, CUMS）動(dòng)物模型采用常用的模式動(dòng)物，如大鼠和小鼠。多選用Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、BALB/c小鼠、昆明小鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[4-9]。關(guān)于大小鼠的選擇，80%的研究選擇了大鼠，雄性多見(jiàn)。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的CUMS刺激因子的多變性、不可預(yù)見(jiàn)性是模型成功的關(guān)鍵，單獨(dú)使用一種刺激不能產(chǎn)生理想的效果，每種刺激因子應(yīng)間隔3～7 d[10]，大部分CUMS造模過(guò)程都選擇了7-11種刺激因子，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)選擇了≥12或≤6種的刺激因子，最少的用了4種，最多的用了14種。造模周期有2-8周不等，其中以3-6周最為常見(jiàn)。本模型選用適宜的造模時(shí)間-35天，以及常用的幾種刺激因子，確定該模型誘導(dǎo)的抑郁模型為現(xiàn)代人類長(zhǎng)期處于慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激作用下誘發(fā)的抑郁癥機(jī)理研究、防護(hù)和藥物研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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