三轉(zhuǎn)基因銀屑病小鼠模型

該模型通過埋植雌激素，進(jìn)而建立了皮膚型狼瘡動(dòng)物模型，主要是檢測(cè)其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類似模型，創(chuàng)新點(diǎn)在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。目前國(guó)際無報(bào)道。

無安全性問題。

（一）三轉(zhuǎn)基因小鼠基因型

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9-14d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增目的基因片段來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠，三種目的基因片段分別為PLAU基因545bp，PLAUR基因475bp，STAT3基因550bp（圖1）。

圖1 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型

注：P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；W：空白對(duì)照；M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記； 1、4、7是F0代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；2、3、5、6、8是F0代陰性小鼠。

（二）人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因的表達(dá)

首先用Western blot 分析1月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中人PLAU，PLAUR及鼠STAT3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示三種蛋白在皮膚中均有表達(dá)，表達(dá)量各有差別（圖2）。

注：WT：野生型小鼠；TG1、TG4、TG7：轉(zhuǎn)基因小鼠；內(nèi)參：β-actin。

（三）轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠表皮差異

Westernblot 結(jié)果顯示TG4皮膚中主要高表達(dá)PLAU和STAT3，而TG7皮膚中PLAU，PLAUR和STAT3均高表達(dá)。 和TG4小鼠比較TG7小鼠表型更明顯，說明三種基因同時(shí)表達(dá)對(duì)病理發(fā)生是關(guān)鍵。TG7小鼠在1月齡就表現(xiàn)腹部毛發(fā)稀疏，無光澤，表皮粗糙，至4月齡表現(xiàn)典型腹部皮膚紅腫和炎癥（圖3）。皮膚炎癥主要表現(xiàn)在腹部，背部表型不明顯。除皮炎表型外，小鼠生育和發(fā)育無異常。

（四）皮膚病理表型

選用4月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同齡野生小鼠，取背部及腹部皮膚，HE染色，鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠真皮變簿（圖4A），表皮過度角化和棘層增厚（圖4B），毛囊減少和發(fā)育異常，部分毛囊內(nèi)未見毛干（圖4C），角化不全區(qū)域內(nèi)可見中性白細(xì)胞構(gòu)成的小膿腫（Munro氏小膿腫）和真皮炎細(xì)胞浸潤(rùn)（（圖4D）。

圖4 病理觀察

注：對(duì)4月齡野生型小鼠（WT）和三轉(zhuǎn)基因基因小鼠（TG7）的腹部皮膚進(jìn)行H&E染色和病理觀察，顯示轉(zhuǎn)基因小鼠真皮變薄（A，白色箭頭所示），表皮過度角化（B，黑色箭頭所示）和棘層增厚（B， 黃色箭頭所示），毛囊減少和發(fā)育異常（C，紅色箭頭所示），出現(xiàn)Munro氏小膿腫（D，綠色箭頭所示）和真皮炎細(xì)胞浸潤(rùn)（D，藍(lán)色箭頭所示）。

銀屑病是人類特有的一類疾病，在動(dòng)物中少見，銀屑病動(dòng)物模型的制作主要采用化學(xué)制劑誘導(dǎo)，基因修飾或組織移植等方式制備，可以在一定程度上模擬銀屑癬的病理表型、慢性炎癥等，但是各有優(yōu)缺點(diǎn)。信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducerand activator of transcription 3，STAT3）是STAT轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，STAT3參與皮膚傷口的愈合、角質(zhì)細(xì)胞遷移、毛囊生長(zhǎng)、抵抗皮膚的放射損傷等，皮膚轉(zhuǎn)基因表達(dá)活化的STAT3可引發(fā)類似銀屑病的病變，而抑制STAT3表達(dá)可以改善銀屑病癥狀；尿激酶型纖溶酶激活劑（Plasminogenactivator, urokinase，PLAU）是多種血纖維蛋白溶酶原的激活因子，PLAU 和PLAU受體（Plasminogenactivator, urokinase receptor，PLAUR，）也叫做UPAR或CD87，都在皮膚組織表達(dá)，PLAU/PLAUR表達(dá)升高可能是銀屑病發(fā)生的重要原因。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將STAT3、PLAU和PLAUR同時(shí)轉(zhuǎn)入小鼠基因組，建立皮膚特異表達(dá)三種基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠表現(xiàn)毛囊發(fā)育異常、表皮過度增生和慢性炎癥，可以作為多病因綜合小鼠銀屑病。

用PCR的方法克隆人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因的開放閱讀框，，均插入表皮特異性表達(dá)啟動(dòng)子下游構(gòu)建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種表達(dá)載體。用顯微注射法將三種混合后的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備三轉(zhuǎn)基因銀屑病小鼠

一、疾病名稱

銀屑病（牛皮癬，Psoriasis）是一種以表皮過度增生和真皮慢性炎癥反應(yīng)為特征的常見皮膚病。白色人種發(fā)病率較高約為2-5%，黃種人發(fā)病率較低約為0.5%, 難根治，易復(fù)發(fā)。目前發(fā)病原因不明，與呼吸道感染，胃炎，飲食習(xí)慣，精神緊張、憂慮，不當(dāng)使用激素藥物等有關(guān)。

二、疾病臨床表現(xiàn)及致病機(jī)制

（一）銀屑病根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為四種類型：

1.尋常型銀屑病

為最常見的一型，多急性發(fā)病。典型表現(xiàn)為境界清楚、形狀大小不一的紅斑，周圍有炎性紅暈。稍有浸潤(rùn)增厚。表面覆蓋多層銀白色鱗屑。鱗屑易于刮脫，刮凈后淡紅發(fā)亮的半透明薄膜，刮破薄膜可見小出血點(diǎn)（Auspitz征）。皮損好發(fā)于頭部、骶部和四肢伸側(cè)面。部分患者自覺不同程度的瘙癢。

2.膿皰型銀屑病

較少見，分泛發(fā)型和掌跖型。泛發(fā)性膿皰型銀屑病是在紅斑上出現(xiàn)群集性淺表的無菌性膿皰，部分可融合成膿湖。全身均可發(fā)病。以四肢屈側(cè)和皺褶部位多見，口腔黏膜可同時(shí)受累。急性發(fā)病或突然加重時(shí)常伴有寒戰(zhàn)、發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、全身不適和白細(xì)胞計(jì)數(shù)增多等全身癥狀。多呈周期性發(fā)作，在緩解期往往出現(xiàn)尋常型銀屑病皮損。掌跖膿皰病皮損局限于手足，對(duì)稱發(fā)生，一般狀況良好，病情頑固，反復(fù)發(fā)作

3.紅皮病型銀屑病

又稱銀屑病性剝脫性皮炎，是一種嚴(yán)重的銀屑病。常因外用刺激性較強(qiáng)藥物，長(zhǎng)期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，減量過快或突然停藥所致。表現(xiàn)為全身皮膚彌漫性潮紅、腫脹和脫屑，伴有發(fā)熱、畏寒、不適等全身癥狀，淺表淋巴結(jié)腫大，白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高。

4.關(guān)節(jié)病型銀屑病

又稱銀屑病性關(guān)節(jié)炎。銀屑病患者同時(shí)發(fā)生類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎樣的關(guān)節(jié)損害，可累及全身大小關(guān)節(jié)，但以末端指（趾）節(jié)間關(guān)節(jié)病變最具特征性。受累關(guān)節(jié)紅腫疼痛，關(guān)節(jié)周圍皮膚也常紅腫。關(guān)節(jié)癥狀常與皮膚癥狀同時(shí)加重或減輕。血液類風(fēng)濕因子陰性。

（二）目前認(rèn)為，本病的發(fā)生不是單一的原因，可能涉及多方面。

1.遺傳

相當(dāng)一部分患者有家族性發(fā)病史，有的家族有明顯的遺傳傾向。一般認(rèn)為有家族史者約占30%。發(fā)病率在不同人種差異很大。銀屑病是遺傳因素與環(huán)境因素等多種因素相互作用的多基因遺傳病。本病患者的某些HLA抗原出現(xiàn)率顯著增高。銀屑病與其他疾病（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，特應(yīng)性皮炎等）遺傳位點(diǎn)可能存在重疊。

2.感染

許多學(xué)者從體液免疫（抗鏈球菌組），細(xì)胞免疫（外周血及皮損T細(xì)胞）、細(xì)菌培養(yǎng)和治療等方面均證實(shí)鏈球菌感染與銀屑病發(fā)病和病程遷延有關(guān)。在銀屑病患者，金黃色葡萄球菌感染可使皮損加重，這與金葡菌外毒素的超抗原有關(guān)。本病的發(fā)生與病毒（如HIV病毒）和真菌（如馬拉色菌）感染雖然有一定關(guān)系，但其確切機(jī)制尚未能最后證實(shí)。

3.免疫異常

大量研究證明銀屑病是免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，其發(fā)病與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子有關(guān)。

4.內(nèi)分泌因素

部分女性患者妊娠后皮損減輕甚至消失，分娩后加重。

5.其他

精神神經(jīng)因素與銀屑病的發(fā)病有一定關(guān)系。飲酒、吸煙、藥物和精神緊張可能會(huì)誘發(fā)銀屑病。