睡眠干擾所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 睡眠干擾對動物體重及自主活動的影響

通過對同一批動物慢性睡眠干抗不同時間體重的檢測結(jié)果表明，慢性睡眠干擾７天時，模型組動物體重明顯減輕，到慢性睡眠干擾14天，模型組動物體重有恢復(fù)趨勢，說明模型組動物的狀態(tài)從不適應(yīng)造模到適應(yīng)再到不適應(yīng)的過程。自主活動實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，慢性睡眠干擾14天對小鼠的總路程、運(yùn)動時間和靜止時間等指標(biāo)均無顯著性影響。

表1 不同強(qiáng)度睡眠干擾對小鼠自主活動的影響

2. 新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對照組相對辨別指數(shù)顯著大于０，說明對照組動物對熟悉物體有記憶，能夠辨別出熟悉物體和新物體；模型組１（滾筒旋轉(zhuǎn)方向：固定）和模型組２（滾筒旋轉(zhuǎn)方向：隨機(jī)）相對辨別指數(shù)與０比較均無顯著性差異，說明模型組動物不能辨別記憶熟悉物體和新物體。

圖2 不同強(qiáng)度的睡眠干擾對小鼠新物體識別相對辨別指數(shù)的影響（模型組1：滾筒方向固定；模型組2：滾筒方向隨機(jī)）

3. 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組１（滾筒旋轉(zhuǎn)方向：固定）定位航行潛伏期在Ｄ１和Ｄ４天顯著増加；模型組２（滾筒旋轉(zhuǎn)方向：隨機(jī)）定位航行潛伏期在Ｄ１、Ｄ４和Ｄ５天均顯著増加。

模型組１（滾筒旋轉(zhuǎn)方向：固定）目標(biāo)象限穿臺次數(shù)有降低趨勢，但無顯著性差異，目標(biāo)象限游程比率和目標(biāo)象限時間比率均無明顯變化；模型組２（滾筒旋轉(zhuǎn)方向：隨機(jī)）目標(biāo)象限穿臺次數(shù)有降低趨勢，但無顯著性差異，目標(biāo)象限游程比率和目標(biāo)象限時間比率均顯著降低。表明長期的慢性睡眠干擾使動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。

圖3 不同強(qiáng)度的睡眠干擾對小鼠水迷宮定位航行潛伏期的影響（模型組1：滾筒方向固定；模型組2：滾筒方向隨機(jī)）

一般選用SPF級Wistar大鼠（8-10周齡）和ICR小鼠（（4-6周齡）。雄性多見。常規(guī)飼養(yǎng)。

1. 模型制作技術(shù)規(guī)程

使用大、小鼠睡眠干擾儀進(jìn)行建模，自行設(shè)定控制參數(shù)，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)，對睡眠干擾儀內(nèi)飼養(yǎng)動物進(jìn)行睡眠干擾。實(shí)驗(yàn)分為兩個階段：

1.1滾筒適應(yīng)期

在睡眠干擾儀內(nèi)水瓶裝滿動物飲用水、食物后，將除去空白對照組之外的動物放入睡眠干擾儀中，設(shè)置干擾參數(shù)如：轉(zhuǎn)速（1r/min），轉(zhuǎn)圈1圈，休息時間（2min），隨機(jī)轉(zhuǎn)動。設(shè)置完成后，選擇“開始”，實(shí)驗(yàn)開始，儀器開始運(yùn)轉(zhuǎn)。每天3小時（每天固定相同時間段），連續(xù)滾筒適應(yīng)3天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后打開滾筒壁取出動物，放回動物房。

圖1 睡眠干擾儀裝置圖

1.2 造模期

滾筒適應(yīng)結(jié)束后開始正式造摸，將除去空白對照組之外的小鼠按上述步驟放入睡眠干擾儀，按適應(yīng)期設(shè)定的參數(shù)，進(jìn)行連續(xù)睡眠干擾至少14天。空白對照組飼養(yǎng)于動物房內(nèi)。

2. 模型分析指標(biāo)

（1）空場實(shí)驗(yàn) 于檢測當(dāng)天將睡眠干擾儀內(nèi)的動物取出提前放于檢測房間進(jìn)行適應(yīng)，腹腔注射給藥30 min后，將小鼠放入自主活動測試箱內(nèi)。待小鼠適應(yīng)測試箱環(huán)境3 min后開始檢測，檢測時間為10 min。計算機(jī)對攝像頭實(shí)時監(jiān)控到的小鼠視頻圖像進(jìn)行分析處理后，得到小鼠的總路程、運(yùn)動時間、靜止時間等一系列指標(biāo)，以此來分析小鼠的自主活動情況。

（2）新物體識別實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過程分為 3 個階段: 適應(yīng)期、熟悉期、測試期。適應(yīng)期為 3d， 每天將動物依次放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，熟悉環(huán)境 10 min。適應(yīng)期結(jié)束后，次日進(jìn)行熟悉和測試。熟悉期時，將兩個完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)對稱的位置處，此兩物體距離側(cè)箱壁、箱后壁的距離均為 10 cm。記錄小鼠鼠 5 min 內(nèi)對兩物體的探索總時間。間隔 30 min 后，進(jìn)入測試期。測試期內(nèi)，將其中一個熟悉物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體，記錄小鼠對新穎物體和熟悉物體的探索時間，用辨別指數(shù) ( discrimination index，DI) 來評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力。辨別指數(shù)計算公式為 DI = ( N-F) /( N + F) ×100% ， 其中N( new) 為新穎物體探索時間，F(xiàn)( familiar) 為熟悉物體探索時間。

在實(shí)驗(yàn)過程中，為避免動物對某一位置產(chǎn)生偏愛，物體的位置要相互平衡，以便減少實(shí)驗(yàn)誤差。新物體識別實(shí)驗(yàn)反映的是動物對物體辨別的短時、非空間記憶能力。

（3）水迷宮實(shí)驗(yàn)

3.1 水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動物逃離水環(huán)境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余 3 個象限作為動物的入水點(diǎn)將動物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練 3 次，每次變換入水點(diǎn)位置( 使動物可分別從 3 個象限入水)，且每天所有動物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng) 10 s，使動物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測時間為 60s 后，將動物放入水中，若動物在 60 s 內(nèi)找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息 10 s。若動物在 60 s內(nèi)未找到平臺，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為 60 s，并引導(dǎo)動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓(xùn)練的時間間隔為 40 min。每天每只動物 3 次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過 5d 的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第 6 天撤去平臺， 進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在 60s 內(nèi)在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數(shù)，作為評價空間記憶能力的指標(biāo)。

睡眠干擾(Sleep Interruption，SI)是指由于環(huán)境或自身原因無法滿足正常睡眠的情況，一般指在24小時中的睡眠小于4小時。睡眠干擾可以分為部分睡眠干擾（partial sleepinterruption, PSI）和完全睡眠干擾（total sleep interruption, TSI）。TSI指24h之內(nèi)完全無睡眠；PSI一般指24h之內(nèi)睡眠量通常達(dá)不到4h。從1896年P(guān)atrick等首次研究睡眠干擾對人體的影響以來，睡眠的重要性受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。包括航空航天航海等軍事特因環(huán)境下，由于晝夜生物節(jié)律顛倒，睡眠周期紊亂，睡眠不足或睡眠障礙，造成作業(yè)人員機(jī)體免疫力、作業(yè)能力、警覺性和判斷力降低，影響作業(yè)任務(wù)的完成，嚴(yán)重者危及生命。

睡眠干擾包括物理和化學(xué)兩種因素誘導(dǎo)的睡眠干擾。化學(xué)藥物(多為一些中樞興奮藥)注射可剝奪部分或全部睡眠，如咖啡因、去氧麻黃堿、神經(jīng)毒素(DSP-4)、可樂定等，但由于睡眠干擾效果不佳，動物個體差異等不易掌握而應(yīng)用較少。物理睡眠干擾方法包括小平臺水環(huán)境、滾筒、水平轉(zhuǎn)盤、跑臺、人工輕觸刺激等方法。由于小平臺水環(huán)境法因頻繁落水造成物溺水死亡率高、人工輕觸刺激需要消耗實(shí)驗(yàn)人員的體力而較少應(yīng)用。目前應(yīng)用較多的滾筒、水平轉(zhuǎn)盤和跑臺等。本文以滾筒法進(jìn)行介紹。