慢性胃腸黏膜損傷樹鼩模型

1. 該模型鑒定和評價的技術方法和指標體系，符合潰瘍性結腸炎的病理特點，尤其與潰瘍性結腸炎反復發作、遷延不愈的臨床特點高度相似。

（1） 疾病活動指數

（2） 結腸指數

（3） 結腸組織大體評分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測

2. 與國內外現有模型的異同

現有的潰瘍性結腸炎的造模方法有單一化學法刺激、免疫法、免疫復合法、基因修飾法。雖然現在建造UC動物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡單易操作，同時盡可能全面、準確的模擬人類UC的病理生理學特點和表現，既要與自發的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進展、組織損傷進展等，同時模型病變盡量維持較長時間，能盡量反映慢性病變的過程和特點，以滿足實驗的需求。而目前尚缺乏能滿足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復性、穩定性，并且操作簡單的動物模型，從而為研究UC發病機制、研發治療新藥物提供良好的基礎。

3. 本研究的主要創新點或技術關鍵

3.1 創新點

本模型采用誘導劑聯用的方法，建立慢性、炎癥維持時間長且病程穩定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進了傳統潰瘍性結腸炎模型的病程短、穩定性差、模型指標缺少特異性等問題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結腸炎病理指標。

3.2 關鍵技術

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導劑聯用、致敏與感染相結合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時間長且病程穩定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過閱讀大量中外文獻，較充分的了解潰瘍性結腸炎疾病以及模型建立過程中的問題。

4.2 實驗單位具備動物飼養許可證以及較先進的實驗器材和檢測設備。

4.3 通過閱讀大量中外文獻和走訪調研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實驗采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動物用水為實驗室制UP水經過除菌處理。飼養及實驗操作均于具有檢驗合格資質的SPF級屏障動物室內進行，并且實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察室適應7天后無異常情況，方可進行實驗。所有實驗中小鼠均引頸處死，盡量減少動物手術創傷程度及失血量。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1. 一般情況的觀察

2mg/kg 劑量組腹腔注射MPTP[2mg/(kg·d)]后，其中有2只樹鼩先后出現了一過性、暫時性的急性帕金森綜合征癥狀(如:行動緩慢，反映遲鈍，四肢無力，步態不穩，不能站立)，2只樹鼩之間表現強弱略有細微差異，均在每天給藥后持續約5 min左右，之后恢復正常。但上述帕金森癥狀是只有在腹44中國比較醫學雜志2018年3月第28卷第3期 Chin J Comp Med，March 2018，Vol．28．No．3腔注射MPTP之后才會出現的急性癥狀，而且此癥狀持續一周之后就不再出現。其它指標和其它樹鼩相同，即腹腔注射后至第3周末，精神狀態、毛色、排糞尿正常，但食欲下降，活動量減少，第4周開始對照組逐漸恢復正常，模型組依舊活動量少，食欲明顯下降，毛皮蓬松沒有光澤，排糞時好時壞，部分

樹鼩糞便呈黑色。

2. 樹鼩體重變化情況

每周稱量體重一次發現，1mg/kg劑量組和2mg/kg劑量組從開始至第8周體重均出現逐漸下降趨勢;對照組從實驗開始到第4周出現體重下降，第4開始逐漸上升直至恢復，如圖1所示。

3. 樹鼩腦脊液中多巴胺含量檢測結果

多巴胺含量檢測結果顯示，模型組樹鼩腦脊液多巴胺含量均比對照組樹鼩的多巴胺含量明顯減少(P＜0.05);1mg/kg劑量組和2mg/kg劑量組比較差異無顯著性(P＞0.05)。提示注射MPTP能選擇性破壞樹鼩中腦黑質多巴胺能神經元，使樹鼩腦脊液中多巴胺含量明顯降低。(見表1)

4. 形態學觀察結果

2mg/kg、1mg/kg劑量組肉眼均可見樹鼩胃腸外形大小、顏色正常;也可觀察到胃腸道表面布滿淤血，內容物呈黑色。體視鏡下兩組均有不同程度的胃腸黏膜損傷，具體表現為，胃黏膜局部充血或有彌漫性出血點，內壁上多處紅腫出血，覆蓋白色苔狀物(如圖2B)，或胃黏膜部分輕微脫落，多處呈異樣粉紅色，內壁上有零星散在輕微出血點(如圖2C)，胃竇與十二指腸則表現為正常無異樣狀況;也有十二指腸黏膜顏色略微加深，覆蓋白色苔狀物，壁上多處紅腫出血，或有散在出血點(如圖2D)。但兩組在胃腸黏膜損傷程度上沒有明顯區別;對照組肉眼和體視鏡下觀察，4只樹鼩胃、十二指腸均無異常表現，胃內容物少，胃腸黏膜完整清潔，結構完整，大小、形態、顏色均正常。結果見圖2。

注:A:對照組胃內壁;B、C:實驗組胃內壁;D:實驗組十二指腸。

5. HE 染色結果

2mg/kg和1mg/kg劑量組大部分樹鼩鏡下見正常胃壁黏膜;胃體黏膜可見少許淋巴細胞及漿細胞浸潤，部分表層黏膜脫落，少部分樹鼩可見胃黏膜損傷明顯，突出表現為黏膜下細胞水腫，部分胃黏膜結構紊亂，伴隨有出血、脫落的壞死黏膜，或有粘膜上皮脫落，固有層充血，并有炎性細胞浸潤，杯狀細胞增多，粘膜下層充血水腫并有炎性細胞滲出，肌纖維間有大量炎性細胞浸潤(如圖3B);胃竇部胃小凹粘膜上皮脫離，固有層出血，并有炎性細胞浸潤，胃腺杯狀細胞增多，少許樹鼩腸腺上皮細胞發生化生，粘膜下層充血，有炎性細胞滲出，肌層細胞發生變性壞死(如圖3C);十二指腸粘膜上皮脫落，固有層充血，粘膜的杯狀細胞增多，部分區域出現了炎細胞的慢性炎癥改變，少許樹鼩有固有層和粘膜下層的結締組織增生，有多量淋巴細胞浸潤(如圖3D)，兩組比較無明顯區別。對照組樹鼩胃腸主細胞、壁細胞形態正常，胃壁漿膜層、肌層、黏膜下層、黏膜層四層結構清晰完整，黏膜層腺體排列整齊。見圖 3。

注:A:對照組胃體;B:實驗組胃體;C:實驗組胃竇;D:實驗組十二指腸。

1. 誘導劑準備

MPTP溶于生理鹽水。

2. 實驗動物

普通級雄性樹鼩。

3. 給藥

造模組和生理鹽水對照組。造模組腹腔給與不同劑量的 MPTP溶液造模。成年健康雄性樹鼩 12 只,隨機分為 3 組，每組 4 只，分別為 2mg/kg 劑量組、1 mg/kg 劑量組和對照組腹腔注射等體積生理鹽水，連續 56 d。

4. 模型分析指標

（1） 腦脊液中胺(dopamine)含量測定

56d后，采用1%戊巴比妥鈉溶液按每100 g體重0.2 mL 劑量對樹鼩腹腔注射麻醉，待樹鼩麻醉后采集腦脊液，用液相色譜儀測量腦脊液中多巴胺(dopamine)含量。

胃腸黏膜損傷導致的胃腸疾病是一種臨床上常見的急、慢性消化系統疾病，常反復發作，給患者的身心健康帶來極大的危害，建立理想的胃腸黏膜損傷性消化道動物模型，對探索該病的病因、發病機制、病變發展規律，明確治療方法及研發新藥均有積極意義。目前報道的胃腸黏膜損傷動物模型造模方法主要有:應激性造模、藥物造模、乙酸或乙醇致胃潰瘍模型等。早期有研究者采用能選擇性破壞中腦黑質多巴胺能神經元的毒性物質 1-甲基-4-苯基-l，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)，腹腔注射大鼠后導致其胃、十二指腸黏膜損傷和潰瘍。