Bmp5短耳小鼠動(dòng)物模型

該模型通過(guò)埋植雌激素，進(jìn)而建立了皮膚型狼瘡動(dòng)物模型，主要是檢測(cè)其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來(lái)確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類(lèi)似模型，創(chuàng)新點(diǎn)在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。目前國(guó)際無(wú)報(bào)道。

無(wú)安全性問(wèn)題。

1.Bmp5短耳（se）小鼠外耳表型

Bmp5純合型短耳小鼠發(fā)現(xiàn)耳廓結(jié)構(gòu)都非常短小，發(fā)育明顯較其正常同胞小，失去正常小鼠耳廓亞結(jié)構(gòu)形態(tài)，小鼠外耳發(fā)育的差異在2周齡時(shí)隨著發(fā)育更加明顯。

2. Bmp5短耳（se）小鼠骨骼阿利新藍(lán)染色方法

選取發(fā)育到40d的短耳小鼠和正常小鼠各3只剝皮處理，放入75%乙醇固定2周，然后放入阿利新藍(lán)工作液中進(jìn)行軟骨染色2 d（根據(jù)樣品大小調(diào)整染色時(shí)間），再放入茜素紅工作液中染色1d，放入1.5%雙氧水溶液中進(jìn)行漂白（肉眼可見(jiàn)色素去除為標(biāo)準(zhǔn)），脫色后依次放入20%、40%、60%、80%的甘油進(jìn)行梯度透明各2周，最后放入100％純甘油中進(jìn)行保存。

A:小鼠全身骨骼染色，左側(cè)為畸形小鼠，右側(cè)為同胞正常小鼠； B: 局部胸廓及肋骨染色，左為畸形小鼠，右為同胞正常小鼠

可見(jiàn)Bmp5短耳（se）純合型突變畸形小鼠的體形較正常野生型較小，特別是胸骨和肋骨的發(fā)育可見(jiàn)明顯的異常，Bmp5短耳（se）純合型突變畸形小鼠胸骨劍突較正常短小，發(fā)育不良，肋骨較細(xì)短，胸廓整體發(fā)育較正常差，小鼠尾骨發(fā)育也較細(xì)短。

Bmp5短耳小鼠動(dòng)物模型(B6.Cg-Bmp5se)

1. Bmp5短耳小鼠繁殖

用同窩的雄性和雌性交配獲得雜合小鼠，得到后代沒(méi)有產(chǎn)生突變的小鼠，這些小鼠也未發(fā)現(xiàn)外耳短小畸形，將雜合小鼠互相再雜交，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要陸續(xù)獲得Bmp5短耳小鼠孕鼠，這些孕鼠可以檢測(cè)出純合型、雜合型和野生型胎鼠。該純合型小鼠是可以生育的，但是純合型相互交配會(huì)得到只有純合型的后代，最好的繁殖策略還是雜合小鼠互相雜交。

2. Bmp5短耳小鼠的基因點(diǎn)突變檢測(cè)

DNA測(cè)序：設(shè)計(jì)引物進(jìn)行Sanger法測(cè)序，應(yīng)用試劑盒法裂解鼠尾提取DNA洗脫出的DNA于-20℃保存。通過(guò)引物3在線平臺(tái)(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)候選變異引物，引物序列如下：Bmp5正向引物為GGAGGCATTACAAAGAGTTTCG，反向引物為GAACCATTTCACCAGCTCCT。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)體系：金牌Mix(green)27μl，正向引物1μl，反向引物1μl，模板DNA 1μl，擴(kuò)增產(chǎn)物由擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

Bmp5短耳小鼠野生型（上）、雜合型（中）和純合型（下）的測(cè)序峰圖，Bmp5點(diǎn)突變位置在外顯子2倒數(shù)第7個(gè)堿基，堿基由C突變?yōu)門(mén)。

小耳畸形的病因目前還不完全明確，環(huán)境和遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的重點(diǎn)。先天性小耳畸形在基因突變致病性研究方面還沒(méi)有闡明小耳畸形胚胎發(fā)育的機(jī)制。小耳畸形主要涉及胚胎發(fā)育期間第一和第二鰓弓的異常，主要表型涉及外耳發(fā)育異常。外耳的耳廓是由第一和第二鰓弓的逐漸融合形成的，在發(fā)育過(guò)程中第一和第二鰓弓之間是相互作用，兩弓之間的凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的起源來(lái)分析，外耳的發(fā)育至少在一定程度上是由第一和第二鰓弓通過(guò)后腦的部分區(qū)域來(lái)介導(dǎo)的，后腦是鰓弓的神經(jīng)嵴細(xì)胞的來(lái)源，在后腦的第四段基因突變可以導(dǎo)致外耳的發(fā)育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的先天發(fā)育性結(jié)構(gòu)異常，其嚴(yán)重程度主要表現(xiàn)為從輕度結(jié)構(gòu)異常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狹窄和外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常， 畸形嚴(yán)重者耳廓全部消失， 絕大多數(shù)患者僅遺留花生狀或貝殼狀的殘耳組織。同時(shí)一些小耳畸形患者也常合并顱面部畸形，中耳及半側(cè)顏面骨及軟組織發(fā)育不良等。

Bmp5短耳小鼠基因突變屬于自發(fā)性突變，也可以說(shuō)是自發(fā)性點(diǎn)突變，位于第9號(hào)染色體，Bmp5點(diǎn)突變位置在外顯子2倒數(shù)第7個(gè)堿基，堿基由C突變?yōu)門(mén)，在氨基酸208處產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子，終止密碼子的產(chǎn)生使肽鏈的正常合成發(fā)生終止，該突變的產(chǎn)生可能會(huì)影響B(tài)mp5 蛋白質(zhì)功能，進(jìn)一步影響蛋白網(wǎng)絡(luò)信號(hào)的傳導(dǎo)。