宏基因檢測（NGS）在病源微生物檢測中的應用?實驗員分享微生物日常檢驗過程注意事項?健明迪

感染性疾病是當今世界嚴重要挾人類安康的嚴重疾病。目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原體出現多樣化和復雜化的開展趨向。近年來快速開展的NGS技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物停止檢測，打破了傳統微生物檢驗的局限性，在臨床微生物范圍展現了寬廣的前景。

感染性疾病簡介

感染性疾病多為細菌、病毒和真菌等病原體及其產物所惹起的局部或全身性炎癥或器官功用阻礙，具有較大的危害性和較高的病死率。目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原體出現多樣化和復雜化的開展趨向。

重癥急性呼吸綜合征、新型冠狀病毒感染、新變異型克雅病、H7N9 禽流感等新發感染性疾病不時出現。而HIV、多重或廣譜耐藥的結核分枝桿菌、沙眼支原體等經典感染性疾病病原體又死灰復燃或出現新的致病特征。各種新發和再發的感染性疾病、不易發現的多重感染以及不明病因的發熱等，都給人類安康帶來了龐大的要挾，因此，臨床上對感染性疾病診斷的準確性和時效性提出了更高的要求。

感染性疾病診斷現狀

快速、準確的診斷是有效治療、病情監測和控制疾病蔓延的重要前提。隨著分子檢測技術的不時開展和完善，分子檢測在病原微生物感染診斷及治療監測上的臨床運用日益普遍，已成為一些重要的感染性疾病的診斷和療效評價中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子檢測方法主要包括：基于PCR的電泳法、實時熒光定量PCR（QPCR）、數字PCR、基因芯片技術、測序技術（Sanger測序技術、焦磷酸測序技術、高通量測序技術）等。

在感染性疾病范圍中，取得病原體的活體（關于細菌、真菌、病毒而言，主要是培育陽性），是感染性疾病診斷的金規范，但病原體的體外培育耗時普遍較長，操作步驟繁瑣，且絕大少數病原體不可培育；免疫學方法（如補體結合實驗、中和實驗、酶聯免疫吸附實驗、免疫熒光法和酶標斑點免疫法等）操作復雜，但由于病原體種類單一，已研發的抗原、抗體數量遠遠不能滿足市場需求；PCR 檢測具有極高的靈敏度和特異性，但無法完成高通量篩查，檢出率較低；基因芯片技術只能對已知的病原體基因組停止意向性篩查， 而無法檢測新的未知病原體。據統計，約70%的感染性疾病患者因傳統檢測方法無法確定病原體信息，不能失掉及時有效地救治，從而使病情好轉。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測方法，對有效診斷和及時防治感染性疾病具有重要的意義。

近年來快速開展的NGS技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物停止檢測，打破了傳統微生物檢驗的局限性，在臨床微生物范圍展現了寬廣的前景。

NGS 在臨床微生物檢測中的運用

1. 感染性疾病的病原體鑒定

傳統的病原微生物鑒定方法主要有涂片鏡檢、分別培育、生化反響和質譜等方法，但其存在周期長、進程復雜及靈敏度高等缺陷，如分枝桿菌菌種鑒定需求長達30～40 d的時間，而一些苛養菌及病毒對培育條件要求*苛刻，甚至不能培育。以PCR 為基礎的分子診斷技術處置了上述局部病原體鑒定的效果，但難以處置未知微生物的檢測難題未知微生物在未知核酸序列時無法設計引物，成為這類技術的*阻礙。NGS檢測則無需對病原體停止分別培育，也不依賴已知核酸序列，可直接對標本停止測序鑒別，大大節省了檢測時間，提高了診斷效率，在對未知物種及難以培育的病原體鑒定方面具有無與倫比的優勢。

NGS 在病原體鑒定方面的運用主要有2種方式 ， 即rRNA基因測序和全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）。rRNA 基因測序在臨床上常用于細菌、真菌的鑒定，同時也是菌群剖析的基礎。WGS與rRNA基因測序相比，可獲取的信息愈加片面，適用于病毒鑒定。因大局部病毒不可培育，且高度變異，NGS 與 Sanger測序、基因芯片等法相比，效率更高，且無需設計特定探針，更適宜用于復雜臨床標本中的病毒鑒定。

2. 病原體分型及盛行溯源

病原體分型方法包括基因組重復序列擴增、隨 機擴增多態性 DNA、脈沖場凝膠電泳、多位點序列分型技術等。這些技術可檢測病原體的型別，但分辨率較低，關于相似或變異度極高的病原體如病 毒等則常無法區別，而 NGS則補償了此項缺陷，其可檢測病原體全基因組序列，取得全部遺傳信息，被以為是分辨率*的病原體分型方法。近年來，隨著抗生素的不規范運用甚至濫用，使細菌耐藥狀況日益突出，耐藥菌株在醫院內的爆發盛行時有發作。因此，對盛行細菌停止追蹤和溯源十分重要。在對耐藥菌等病原體停止分型的基礎上，判別同源性遠近，分辨出不同的退化路途，可追蹤或預防盛行性疾病的大爆發。

3. 病原體耐藥及毒力特征檢測

在抗生素和宿主免疫等多重要素的壓力下，病原體在毒力和耐藥方面均發作了相應改動。各種高毒力株及耐藥株的出現是招致感染性疾病發病率和病死率居高不下的重要緣由。臨床上病原體耐藥及毒力特征的檢測慣例采用體外藥物敏感性實驗、耐藥菌表型檢測或核酸擴增等方法。這些方法操作繁瑣，且較費時、費力。NGS 通量高、快速，在一次測序反響中即可取得細菌整個基因組的耐藥、毒力等相關基因信息，同時還可對目的基因、基因定位、基因環境、質粒相關序列等展開片面研討，有助于提醒病原體毒力及耐藥機制，對臨床治療及指點用藥均具有重要意義。

4. 與人體疾病相關的微生態失衡宏基因組

宏基因組學（Metagenomics）以微生物生態群落中一切微生物的基因組為研討對象，經過研討群落中物種組成和功用組成、同一個群體內不同微生物的相互作用、微生物群落與宿主之間的相互作用，并停止不同表型的樣品比擬、剖析，來解釋生物學 現象。近年來，NGS 技術越來越普遍地被運用于腸道微生物范圍的宏基因組學研討。多項研討標明，腸道菌群與宿主共生并共退化的進程中，在營養、代謝及免疫等多個方面影響著人體安康。腸道微生態失衡與人體多種疾病，如感染性疾病、瘦削癥、糖尿病、肝病、冠心病及腫瘤等之間存在親密關系。

腸道微生物宏基因組學研討則為研討腸道微生物與相關疾病的關系開拓了新途徑，是近年來研討的熱點。腸道微生物中關鍵功用菌更是有能夠成為疾病診治的新型生物標志物和治療靶點。此外，病毒宏基因組測序直接以環境中一切病毒的遺傳物質為研討對象，可快速鑒定一切病毒組成，在對已知或未知病毒病原體的及時發現和靜態監測等方面具有突出優勢，對病毒感染性疾病的防治有 重要意義。NGS因其測得數據量大、本錢低、速度快的特點，無疑將成為研討腸道微生物和宏基因組學的有力工具。

NGS 在運用中面臨的應戰

目前，NGS 技術慣例運用于臨床病原學檢測仍存在很多實踐效果:

• 病原體鑒定的準確度很大水平取決于剖析的參考數據庫的范圍和完整性;
• 臨床標本的復雜性，能夠使病原體信息太少而招致數據喪失或病原體數據混雜在正常菌群中難以區分;
• NGS測序數據的解讀至關重要，測序的長度、數量、質以及試劑能夠的細菌污染，均可影響病原體識別，招致標本中細菌多樣性估量過高;
• 目前尚未樹立不同標本測序前處置和參數設置的一致規則，微生物 NGS測序質量評價、質量控制體系亦尚在樹立中。

中國基因檢測行業市場快速開展，增長速度遠超全球水平，未來市場空間龐大，估量2020年將增長至378.8億元人民幣。我國作為人口大國，基因檢測行業已成為國度“精準醫學”戰略規劃的重要組成局部，開展前景寬廣，而病原微生物基因檢測的市場有愈加寬廣的空間值得我們去開拓。

參考來源：

1. 新一代測序技術在臨床微生物檢測中的運用

2. 感染性疾病病原學診斷新技術與臨床運用戰略

3. 宏基因組測序在感染性疾病病原體檢測中的運用