內(nèi)毒素血癥IL-1R8基因敲除小鼠模型

目前對(duì)于IL-37a的研究并不深入，作為一種新型炎癥抑制因子其可能與IL-37b具有相近的功能與作用機(jī)制，IL-1R8具有顯著抑制炎癥反應(yīng)的功能，已被證明為IL-37b的受體，我們的研究證明IL-1R8也是IL-37a的受體。IL-1R8基因敲除小鼠模型能夠廣泛應(yīng)用于IL-37a參與調(diào)控的各種免疫或炎性癥疾病的研究。

本模型于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物房構(gòu)建，由遺傳中心技術(shù)人員進(jìn)行相關(guān)操作，制備過程中的監(jiān)督管理、處置措施、微生物菌株管理、細(xì)胞系描述、遺傳分析、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響的評(píng)估等均嚴(yán)格按照研究所關(guān)于動(dòng)物資源制備的相關(guān)規(guī)定或措施開展。

目前對(duì)于IL-37a的研究并不深入，作為一種新型炎癥抑制因子其可能與IL-37b具有相近的功能與作用機(jī)制，IL-1R8具有顯著抑制炎癥反應(yīng)的功能，已被證明為IL-37b的受體，我們的研究證明IL-1R8也是IL-37a的受體。IL-1R8基因敲除小鼠模型能夠廣泛應(yīng)用于IL-37a參與調(diào)控的各種免疫或炎性癥疾病的研究。

1、基因型鑒定

2、基因表達(dá)

qPCR檢測(cè)IL-1R8基因敲除小鼠脾臟中IL-1R8 mRNA的表達(dá)。

3、表型特征

內(nèi)毒素血癥

IL-1R8基因敲除小鼠在LPS誘導(dǎo)的致死性休克疾病中，與野生型小鼠相比較，死亡率更高。檢測(cè)其血清中相關(guān)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果顯示，IL-1R8小鼠產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平更高，與其高致死率的表型相符。

1、實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本模型構(gòu)建用到的小鼠均來自于本研究所遺傳中心。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為GR18001。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器

（3）試劑

2、模型構(gòu)建環(huán)境

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。

3、模型構(gòu)建方法

1）構(gòu)建策略

CRISPR/Cas9構(gòu)建方法。

2）構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)并合成sgRNA。

靶點(diǎn)1：

M-SIGIRR-gRNA-UP15’TAGGCTGTTGTACTCTTTCTGC

M-SIGIRR-gRNA-DOWN15’AAACGCAGAAAGAGTACAACAG

靶點(diǎn)2：

m-SIGIRR-grna-up25’taGGcttctggtaagaaggcatcc

m-SIGIRR-grna-down25’AAACGGATGCCTTCTTACCAGAAG

3）合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。

4）構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。

5）顯微注射

（1）超數(shù)排卵：15只3-4周齡C57BL/6J鼠注射激素進(jìn)行超排。

（2）受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。

（3）雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的C57BL/6J鼠。

（4）受體鼠制備：8-10周齡C57BL/6J鼠與結(jié)扎的C57BL/6J鼠交配后選取見栓的雌鼠。

（5）胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

6）基因型鑒定

（1）剪尾編號(hào)：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號(hào)及取材。

（2）基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

（3）PCR檢測(cè)：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物并進(jìn)行PCR檢測(cè)。

7）結(jié)果分析：選取通過PCR檢測(cè)后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號(hào)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測(cè)序。

一、疾病概述

內(nèi)毒素血癥是由于血中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起的一種病理生理表現(xiàn)。內(nèi)毒素血癥分為內(nèi)源性和外源性兩大類。內(nèi)毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對(duì)內(nèi)毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細(xì)胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克等。

二、模型背景

1、小鼠IL-1R8基因信息

IL-1R8基因位于小鼠7號(hào)染色體，又稱Sigirr（single immunoglobulin and toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain）。屬于白介素1受體家族。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6J

3、研究背景

目前對(duì)于IL-37a的研究并不深入，作為一種新型炎癥抑制因子其可能與IL-37b具有相近的功能與作用機(jī)制，IL-1R8已被證明為IL-37b的受體，我們的研究證明IL-1R8也是IL-37a的受體。IL-1R8基因敲除小鼠模型能夠廣泛應(yīng)用于IL-37a參與調(diào)控的各種免疫或炎性癥疾病的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李夢(mèng)媛，韋榮飛，楊星九等.全長與成熟形式IL?37b的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2018,28（2）:59-63.

[2] 李夢(mèng)媛，燕正強(qiáng)，韋榮飛等.IL?37b通過抑制樹突狀細(xì)胞相關(guān)的免疫應(yīng)答緩解感染性休克[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2017,27(11)44-49.

[3] 李夢(mèng)媛，韋榮飛，徐大模等.人IL?37b在大腸埃希菌中的表達(dá)、純化及活性鑒定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2017，27（3）:20-24.

[4] 李夢(mèng)媛，楊星九，徐大模等.IL-37對(duì)炎癥相關(guān)性疾病的抑制作用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（12）:75-80.

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