slc25a26基因敲除心肌肥厚小鼠模型

SLC25a26敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個(gè)總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。條件性基因敲除（Conditional Knockout,CKO），是可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細(xì)胞表達(dá)正常。相較于CKO，KO小鼠采集任意組織器官的cDNA，PCR擴(kuò)增，即可鑒定是否目的基因敲除成功。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿(mǎn)足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。

SLC25a26，該基因?qū)儆诰€粒體載體家族，是定位于線粒體內(nèi)膜上的核編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。臨床發(fā)現(xiàn)包括由呼吸功能不全和水腫引起的新生兒死亡、兒童急性發(fā)作心肺衰竭和緩慢進(jìn)行性肌無(wú)力。研究發(fā)現(xiàn)SLC25A26突變會(huì)導(dǎo)致各種線粒體缺陷，包括那些影響RNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)修飾、線粒體翻譯以及CoQ10和硫辛酸的生物合成的缺陷。而對(duì)于該基因在人類(lèi)衰老階段是否會(huì)在肺結(jié)核、心血管疾病中發(fā)揮功能卻鮮有研究，該研究為Nap1l5的研究提供了新的方向與思路。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門(mén)采用專(zhuān)用凈化密閉門(mén)并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過(guò)初、中、三級(jí)過(guò)濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開(kāi)關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開(kāi)啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門(mén)真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤(pán)和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1、SLC25a26蛋白在TAC手術(shù)模型中表達(dá)上調(diào)

由圖1的WB結(jié)果可以看出，在TAC手術(shù)的模型中，術(shù)后4周SLC25a26的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，且兩次實(shí)驗(yàn)具有比較一致的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)證明SLC25a26在心肌肥厚的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 SLC25a26蛋白在TAC手術(shù)模型中表達(dá)上調(diào)。

2、SLC25a26可以抑制心肌肥厚

為了進(jìn)一步探究SLC25a26在心肌肥厚發(fā)生中的具體功能，我們通過(guò)siRNA對(duì)心肌細(xì)胞中的SLC25a26進(jìn)行了敲低，圖2A敲低水平的檢測(cè)，證明siSLC25a26能夠顯著敲低SLC25a26的表達(dá)；敲低SLC25a26后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp及Myh7在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)表達(dá)（圖2B、2C、2E），而Myh6卻明顯受到了抑制（圖2D），說(shuō)明SLC25a26在體外確實(shí)可以抑制肥厚。

圖2 敲低SLC25a26可以加重心肌肥厚。（A）SLC25a26的敲低水平驗(yàn)證；（B-E）敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh6和Myh7在心肌細(xì)胞中的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vsControl組；P< 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs siNeg組。

鑒定結(jié)果示意圖：

1．項(xiàng)目策略概述

利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄 gRNA，將 Cas9、 gRNA 同時(shí)注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)進(jìn)而造成 DNA 雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)堿基序列缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

2. Western bloting

用RIPA裂解液從冷凍小鼠心臟組織中提取蛋白質(zhì)，形成蛋白溶液。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE對(duì)每個(gè)樣品中等量的蛋白質(zhì)（20μg）進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉這些膜1小時(shí)后，將這些膜與以下相對(duì)應(yīng)的一抗在4℃下孵育過(guò)夜：SLC25a26（1:1000）、和GAPDH（1:2000）。然后，在室溫下與一抗相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合二抗孵育2h。后使用化學(xué)發(fā)光顯影液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯示目標(biāo)條帶，并將目標(biāo)條帶用imageJ (National Institutes of Health)進(jìn)行量化分析。以每個(gè)樣本中的GAPDH蛋白含量作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到每個(gè)樣本中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3. 熒光定量PCR

心肌肥厚分子標(biāo)志物檢測(cè)。使用TRIzol從將各實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟組織中提取總RNA，合成cDNA，然后采用SYBR Green PCR MasterMix進(jìn)行熒光定量PCR。將內(nèi)源性GAPDH的mRNA含量設(shè)為對(duì)照檢測(cè)心肌肥厚指標(biāo)Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對(duì)稱(chēng)肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現(xiàn)：1. 以青壯年多見(jiàn)、常有家族史。 2. 可以無(wú)癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。 3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點(diǎn)異丙腎上腺素及Valsalva動(dòng)作后雜音增強(qiáng)，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時(shí)雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對(duì)性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。臨床診斷：超聲心動(dòng)圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。二、模型背景1、SLC25a26基因信息SLC25a26，該基因?qū)儆诰€粒體載體家族，是定位于線粒體內(nèi)膜上的核編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該家族成員運(yùn)輸重要的小分子穿過(guò)線粒體內(nèi)膜。該蛋白參與s -腺苷蛋氨酸(SAM)進(jìn)入線粒體的運(yùn)輸。該基因的突變與聯(lián)合氧化磷酸化缺陷有關(guān)。? 敲除基因名稱(chēng)（ NCBI 號(hào)）： SLC25a26（67582）? 基因 NCBI 網(wǎng)址鏈接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 67582? 敲除基因名稱(chēng)： SLC25a26? 方案針對(duì)的轉(zhuǎn)錄本（ Ensembl 號(hào)）：ENSMUST00000061118.102、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來(lái)源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無(wú)眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對(duì)放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對(duì)結(jié)核桿菌敏感。對(duì)鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類(lèi)脂質(zhì)濃度低。對(duì)百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 腺苷蛋氨酸(SAM)是主要的甲基供體，有一個(gè)大光譜的目標(biāo)底物。因此，它對(duì)幾乎所有的生物甲基化反應(yīng)都是必不可少的。SAM是由胞漿中蛋氨酸和ATP的蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶合成的，隨后分布在不同的細(xì)胞間隔中，包括線粒體，其中甲基化主要用于核酸修飾和呼吸鏈功能。臨床發(fā)現(xiàn)包括由呼吸功能不全和水腫引起的新生兒死亡、兒童急性發(fā)作心肺衰竭和緩慢進(jìn)行性肌無(wú)力。研究發(fā)現(xiàn)SLC25A26突變會(huì)導(dǎo)致各種線粒體缺陷，包括那些影響RNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)修飾、線粒體翻譯以及CoQ10和硫辛酸的生物合成的缺陷。 SLC25A26是s -腺苷蛋氨酸載體(S-adenosylmethionine carrier, SAMC)的編碼基因，是線粒體載體家族的一員，是一組存在于線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1, 2]。SAMC的生理作用是催化SAM(通用的甲基供體)從細(xì)胞質(zhì)攝取到線粒體，在那里它是DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化所必需的，也是硫辛酸和泛醌生物合成的中間體[3]。SAM是通過(guò)蛋氨酸循環(huán)途徑在胞漿中產(chǎn)生的，在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶的催化下，腺苷從ATP轉(zhuǎn)移到蛋氨酸。SAM進(jìn)入線粒體的運(yùn)輸嚴(yán)格依賴(lài)于其合成，已知合成受到細(xì)胞質(zhì)代謝和線粒體代謝的調(diào)控[4]。線粒體代謝通過(guò)ATP和葉酸的合成來(lái)調(diào)節(jié)SAM的產(chǎn)生，葉酸循環(huán)反應(yīng)在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中被復(fù)制。此外，甲硫[5]于由同型半胱氨酸產(chǎn)生的胱氨酸b合酶(cystathionine b synthase, CBS)被SAM變構(gòu)激活，半胱氨酸產(chǎn)生的谷胱甘肽與胞質(zhì)SAM的濃度密切相關(guān)，而胞質(zhì)SAM的濃度取決于胞質(zhì)中產(chǎn)生的量并轉(zhuǎn)入線粒體[6]。同樣，SAM對(duì)線粒體的可用性可能強(qiáng)烈地改變線粒體甲基化靶點(diǎn)的功能。線粒體DNA (mtDNA)就是這些靶點(diǎn)之一。已知甲基化修飾mtDNA[7]，導(dǎo)致正常和病理?xiàng)l件下mtDNA編碼基因表達(dá)改變[8-10]。 在不同的正常或病理?xiàng)l件下，SAM對(duì)線粒體的可用性可以改變其線粒體靶點(diǎn)如mtDNA的功能。事實(shí)上，一些研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了在正常和病理?xiàng)l件下mtDNA甲基化變化如何改變mtDNA編碼基因的表達(dá)[8-11]。此外，其他甲基循環(huán)成分(如葉酸)的可用性也會(huì)影響甲基化過(guò)程，葉酸水平通過(guò)某些腫瘤抑制基因中CpG島的高甲基化與發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)成反比[12]。此外，SLC25A26突變導(dǎo)致SAMC功能受損，顯著影響不同的線粒體過(guò)程，如RNA穩(wěn)定性、線粒體翻譯和ATP合成[13]。基于這一證據(jù)，SLC25A26基因的表達(dá)和SAMC的活性有望通過(guò)協(xié)調(diào)幾個(gè)代謝事件對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。然而， SLC25A26在肺結(jié)核及心血管疾病中是否發(fā)揮功能，以及作用機(jī)制是什么還有待我們進(jìn)一步的探究。參考文獻(xiàn)：1. 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