丙型肝炎病毒亞復(fù)制子斑馬魚模型

（一）模型評價方法：

1. 臨床癥狀觀察：

血清中肝功生化指標(biāo)的兩種轉(zhuǎn)氨酶（ALT，AST）是肝損傷的重要標(biāo)志物，GGT的變化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情況，同時對于肝臟腫瘤也具有一定的指示作用。這些指標(biāo)可通過常規(guī)血清檢測得到數(shù)據(jù)。

2. 病毒載量測定方法：

（1）WHV病毒DNA的提取：

血清樣本處理：用促凝采血管收集的血樣，室溫放置30min后，3000rpm室溫離心10min，得到上層血清放入離心管中備用；組織樣本處理：檢測WHV病毒載量主要組織樣本為肝臟，分別在每個肝葉取約50mg樣本，用生理鹽水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至組織破碎完全。使用DNA提取試劑盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需長期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒載量的測定：實時熒光定量PCR方法

實驗前準(zhǔn)備：DNA樣品制備：待測樣本：待檢測的感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的WHV-DNA質(zhì)粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl進行稀釋；空白對照：分子級無菌蒸餾水 (無RNA酶和DNA酶)；陰性對照：未感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清；

實驗步驟：（a）每個待檢測樣本反應(yīng)液的組成為：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）擴增條件設(shè)定：

（3）儀器檢測通道選擇：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測儀時選擇SYBR Green熒光信號，收集設(shè)在58℃。具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。

（4）結(jié)果分析閾值設(shè)定：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測儀進行結(jié)果分析，基線和閾值設(shè)定根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。

（5） 熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：

a. 反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時符合以下條件，否則實驗結(jié)果無效。

陰性對照：無擴增，為陰性。

標(biāo)準(zhǔn)品：CT值＜28

否則結(jié)果無效。

b. 結(jié)果判斷：

陰性：無CT值或CT值大于38

陽性：CT值＜38，可報告為陽性。

CT值大于38的樣本建議重做，若重做結(jié)果CT值＜38，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

陽性樣本具體載量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計算。

圖5. 熒光定量PCR實驗的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

3. 病理分析：HE染色

組織樣本經(jīng)固定、包埋、切片處理后，可通過H&E染色觀察感染動物組織內(nèi)的損傷情況和炎性細胞的浸潤狀況。具體步驟如下：

用10%福爾馬林固定72h，在24h內(nèi)可換液一次；將固定的組織修塊后脫水、透蠟用石蠟包埋；隨后石蠟塊進行切片；石蠟切片脫蠟后，進行蘇木精染色；切片繼續(xù)脫水后染伊紅；最后進行透明、封片，得到HE病理切片，可進行鏡檢。標(biāo)本切片可長期保存。

（二）評價指標(biāo)：

1. 臨床癥狀評價：

由于免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全，新生土撥鼠感染W(wǎng)HV病毒后，有60%-70%的概率發(fā)展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指標(biāo)（ALT和AST）都有升高，表現(xiàn)出肝臟損傷；而長期的病毒復(fù)制導(dǎo)致慢性肝炎，期間雖然血液中檢測的病毒載量會有波動，但肝部損傷加劇，且肝臟炎癥和腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)升高。

2. 病毒復(fù)制情況評價體系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6個月達到峰值，平均載量約為107copies/ml。此后由于機體無法清除病毒，WHV在肝臟中長期復(fù)制，在血液中能持續(xù)檢測到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分時間維持在104copies/ml。

3. 病理評價體系：

WHV病毒感染土撥鼠，在慢性期肝臟病理發(fā)生顯著變化，可觀察到慢性炎癥表型，包括：肝竇擴張，大量炎細胞彌漫浸潤等。

WHV病毒具有種屬特異性，只感染土撥鼠，不感染人和其他實驗動物；且未出現(xiàn)在《人間傳染的病原微生物名錄》中。動物感染病毒和飼養(yǎng)都可在普通環(huán)境中進行，但需跟土撥鼠繁殖區(qū)分開。WHV病毒已經(jīng)過風(fēng)險評估，具有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。模型實驗已得到IACUC批準(zhǔn)，獲得實驗資質(zhì)。

WHV病毒只對土撥鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的實驗動物；在土撥鼠種群中常為垂直感染模式，實驗室中采用的為血液感染模式。為預(yù)防對其他土撥鼠的影響，實驗人員均需經(jīng)過生物安全培訓(xùn)獲得證書，具有生物安全操作資質(zhì)；進入動物房之前，穿戴防護服、口罩、帽子、鞋套等進行防護；實驗結(jié)束后按要求去除防護設(shè)備集中處理。盡量避免進入感染動物區(qū)后再進入繁殖區(qū)，若需進入則應(yīng)更換整套個人防護設(shè)備。

由于感染W(wǎng)HV土撥鼠血液中可能存在著大量病毒，因此對于采血后的耗材、以及沾染到血液的墊料等，都需要進行高壓滅菌處理，以消除正常土撥鼠的潛在感染源。動物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動物實驗操作均在ABSL-2動物房的生物安全柜中進行，實驗后將病毒毒株、動物尸體、尿墊等包裝好進行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 動物癥狀

所建 HCV 亞復(fù)制子模型為 HCV 基因暫態(tài)表達模型，未檢測到對斑馬魚發(fā)育和生長的影響。

2. 模型鑒定

斑馬魚整體的熒光顯微鏡檢測報告基因表達和原位雜交實驗均檢測到 HCV RNA多聚酶（NS5B）/基因和 HCV core 蛋白/基因在肝臟的特異性表達（圖 1A-D）。以 WT型斑馬魚、單獨表達 NS5B 和單獨表達 HCV-core 反義模板的三組斑馬魚為對照，采用 RT-PCR 和 Western blot 檢測，結(jié)果顯示 NS5B 和 CORE 的基因和蛋白的共表達只出現(xiàn)在 HCV 亞復(fù)制子斑馬魚體內(nèi)（圖 1E，1F），證明所建模型的可信性和有效性。

圖 1. 斑馬魚肝臟特異性的 HCV 亞復(fù)制子模型A. HCV 亞復(fù)制子基因構(gòu)件示意圖；B. 熒光顯微鏡檢測 HCV-NS5B 基因在斑馬魚幼體(4 dpf)肝區(qū)特異性表達，紅色熒光代表 NS5B 蛋白(556 nm excitation, 586 nm emission); C.一條 HCV 亞復(fù)制子幼體分別在白光、藍色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下的圖像，顯示 HCV 亞復(fù)制子基因組在肝區(qū)的復(fù)制，以綠色熒光代表 HCV-CORE 蛋白的 (480 nm excitation, 505 nm emission)；紅色熒光代表NS5B 蛋白。D. 幼體原位雜交(WISH)結(jié)果，顯示 HCV mini-RNA 基因組在肝區(qū)表達。標(biāo)尺：150μm。 E.RT-PCR 檢測 HCV core 和 ns5b 基因的表達；在此只有 HCV mini-genome 被復(fù)制后才能檢測到 core 基因。F. Western blotting 驗證 HCV CORE 和 NS5B 蛋白同時在 HCV 亞復(fù)制子幼體內(nèi)表達，而不可同時出現(xiàn)在其它對照組。3. 病理改變HCV病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制可以導(dǎo)致宿主相關(guān)基因表達水平的變化，如HCV效應(yīng)基因：ScarF2、Leugpcr、Rasgbd和Argsyn。我們的檢測結(jié)果表明，這些基因在HCV亞復(fù)制子幼體內(nèi)的表達水平均高于野生型斑馬魚(圖2A)，證明所建HCV亞復(fù)制子模型具有全病毒的一些病理特征。進一步檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR相關(guān)基因，如chop、atf4、atf6和bip基因也均高于野生型斑馬魚(圖2B)。這些基因均與病毒性肝細胞炎性病變相關(guān)。

圖 2. RT-PCR 檢測 HCV 感染相關(guān)的宿主基因表達變化(8 dpf)A. HCV 效應(yīng)基因 ScarF2、Leugpcr、Rasgbd 和 Argsyn 的轉(zhuǎn)錄水平；B. UPR 標(biāo)志基因 chop、atf4、atf6 和 bip 的轉(zhuǎn)錄水平。*p < 0.05; **p < 0.001。

1. HCV 亞復(fù)制子基因載體

HCV 亞復(fù)制子基因載體由兩部分組成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶(NS5B)表達載體。具體構(gòu)建：克隆小鼠肝臟特異的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并將此序列替換我們前期的 HCV 構(gòu)件的 CMV 啟動子，獲得含有 GFP 報告基因的肝臟特異的 mini-HCV genome。克隆斑馬魚的肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因的增強子(L-fabpe)和人肝脂酶啟動子序列(hLP)，并與 NS5B 編碼序列和報告基因 RFP 序列重組到真核細胞表達載體上，獲得肝臟特異的 NS5B 表達載體。這兩個基因構(gòu)件結(jié)構(gòu)圖見圖 1A。

2. 實驗動物

野生型斑馬魚 AB 品系。

3. 造模

取野生型斑馬魚受精卵（1-4 cell 期），通過顯微注射將 HCV 亞復(fù)制子的兩個基2因構(gòu)件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵內(nèi)。正常飼養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至 4 dpf 幼體，進行后續(xù)檢測。4. 模型分析指標(biāo)

（1） 癥狀觀察 以 WT 斑馬魚為對照，觀察斑馬魚幼體表型和生長的變化。

（2） 病毒檢測初篩：熒光顯微鏡下觀察、拍攝幼體內(nèi)報告基因的表達分布：在肝臟有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白共表達的幼體，即為 HCV 亞復(fù)制子模型個體。確證：采用斑馬魚整體原位雜交實驗、RT-PCR 和 Western blot 檢測 HCV 亞復(fù)制子的復(fù)制和 HCV 特異的復(fù)制酶 NS5B 的表達及其肝定位。

Table 1. PCR primers in this study

（3） 病理診斷HCV 基因可導(dǎo)致宿主體內(nèi)病理變化，首先反映在相關(guān)基因表達的變化。我們采用 RT-PCR 和 Western blot 方法檢測了 HCV 的效應(yīng)基因如：Solute carrier family 2(ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和 UPR 相關(guān)基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。

一、疾病名稱

丙型肝炎 (Viral hepatitis type C，HC)

二、臨床發(fā)病機制及癥狀

病毒性肝炎(Viral hepatitis)是由肝炎病毒感染引起的以肝實質(zhì)細胞變性、壞死為主要病變的常見傳染病。常見的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊、庚六型。丙型肝炎病毒(HCV)感染者有 70％可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝祝穷净几渭毎┑闹饕巳骸CV是一種(+)鏈 RNA 病毒，特異性侵襲人的肝臟；HCV 在肝臟細胞內(nèi)的反復(fù)大量復(fù)制、導(dǎo)致宿主細胞病變、不斷侵染周圍正常肝細胞，是導(dǎo)致肝炎遷延不愈、促使肝纖維化、肝硬化，直至肝癌的重要誘因。為此，建立一種可模擬 HCV 復(fù)制過程又可在普通實驗室操作的體內(nèi)模型，可為研究 HCV 復(fù)制機制與宿主免疫和防御機制的相互作用提供實驗研究平臺，具有重要的理論意義和實用價值。

三、模式動物

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio) AB。