結(jié)核分枝桿菌感染樹(shù)鼩模型

該模型的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變?cè)u(píng)分值，該模型與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的經(jīng)典cornell模型類(lèi)似，但是cronell模型的問(wèn)題在于模型潛伏期荷菌量過(guò)高，復(fù)發(fā)期3-9個(gè)月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問(wèn)題，模型均一，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過(guò)低也不過(guò)高），周期明顯縮短，由3-9個(gè)月不等的周期縮短到比較穩(wěn)定的10周，便于應(yīng)用。

該模型不僅可以用于潛伏及復(fù)發(fā)的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復(fù)發(fā)期研究疾病機(jī)制，同時(shí)可以用于評(píng)價(jià)潛伏感染的預(yù)防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動(dòng)物模型的制備的設(shè)計(jì)得到研究所IACUC委員會(huì)的批準(zhǔn)，人員都是訓(xùn)練有素的研究人員和實(shí)驗(yàn)人員，全程在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，完全按照模型制備和檢測(cè)的一系列SOP操作進(jìn)行，遵守生物安全操作要求，無(wú)安全事故。

1體溫、體重、活躍度、血液學(xué)變化

各組體溫?zé)o明顯改變，低劑量組各時(shí)間段體重變化無(wú)明顯規(guī)律，活躍度改變不明顯，高劑量組1只感染后第五周病重死亡，體重降低51.52g，1只感染后八周活躍度明顯降低，體重下降40.74g，余體重變化無(wú)明顯規(guī)律，活躍度改變不明顯。

血常規(guī)檢查：高、低劑量組間血常規(guī)無(wú)明顯變化，兩組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量無(wú)明顯變化，白細(xì)胞總數(shù)升高，淋巴細(xì)胞比例多數(shù)增高。各組血沉均<5mm/h。

2 組織荷菌量

組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)高、低劑量組間無(wú)顯著性差異，各組可見(jiàn)肺、肝、脾、腎、唾液腺、回腸、生殖器均有結(jié)核分支桿菌菌落生長(zhǎng)。

3 組織切片抗酸染色

4病理改變

4.1大體病理改變

如圖3.1所示，感染后五周高劑量組病重死亡一只，體型明顯消瘦，死亡后及時(shí)解剖,胃腸組織有自溶現(xiàn)象，皮下、肋間隙、膈肌、后腹膜可見(jiàn)1-5mm大小不一的結(jié)節(jié)，腎臟肉眼可見(jiàn)灰白色病灶。高劑量組感染后5W、8W共有4只，低劑量組感染后8W1只靜脈注射部位有皮膚潰瘍。2只高劑量組感染后8W、11W胸腔積液約1ml，1只高劑量組感染后11W頭部皮下有膿腫。高劑量組各時(shí)間段肺組織肉眼均可見(jiàn)結(jié)節(jié)狀病灶。

4.2組織病理改變

低劑量組各時(shí)間段組織病理無(wú)特異性改變。

如圖3.2所示，高劑量組感染后5W病重死亡的一只脾臟內(nèi)可見(jiàn)肉芽腫,周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)；肝臟內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；左肺及右肺可見(jiàn)多個(gè)界限清楚的實(shí)變?cè)睿醒雺乃溃車(chē)准?xì)胞浸潤(rùn)；腎間質(zhì)內(nèi)灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腎上腺灶性壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，被膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)；真皮及皮下組織灶性壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肌肉組織灶性壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)（膿腫形成）；感染后5W其余動(dòng)物肺組織未見(jiàn)特異性改變。感染后8W、11W肺組織可見(jiàn)大面積壞死，可見(jiàn)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中央壞死，周?chē)罅垦准?xì)胞浸潤(rùn)。各時(shí)間段可見(jiàn)肝臟內(nèi)小灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎組織內(nèi)灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。出現(xiàn)皮膚潰瘍的動(dòng)物，取潰瘍皮膚病檢，可見(jiàn)真皮及皮下組織出血壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌肉組織大片壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。感染后8W活動(dòng)度明顯減少的動(dòng)物，除上述肺組織特異性的改變，另可見(jiàn)小腦組織灶性壞死，周?chē)倭垦准?xì)胞浸潤(rùn)。

5蛋白質(zhì)譜

為了分析結(jié)核分支桿菌感染樹(shù)鼩肺組織中蛋白質(zhì)表達(dá)變化，分別取高、低劑量組感染的樹(shù)鼩肺組織和正常對(duì)照組的肺組織，利用蛋白裂解液裂解后，通過(guò)iTRAQ定量質(zhì)譜方法分析差異蛋白，在相對(duì)定量時(shí)，如果同一個(gè)蛋白質(zhì)的量在兩個(gè)樣品間沒(méi)有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上或小于0.67倍，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P-value值小于0.05時(shí)，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。高劑量組（TH-A）與低劑量組（TH-B）相比篩選到的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白分別為144和76個(gè)；高劑量組（TH-A）與正常對(duì)照組（TH-C）相比篩選到的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白分別為134和53個(gè)；低劑量組（TH-B）與正常對(duì)照組（TH-C）相比篩選到的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白分別為9和20個(gè)。高劑量組的部分表達(dá)上調(diào)的差異蛋白可能與結(jié)核感染相關(guān)，而在人類(lèi)中，這些蛋白已證實(shí)與結(jié)核感染密切相關(guān)，如表3.1所示。將差異蛋白在KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，以人類(lèi)相關(guān)蛋白為對(duì)照，差異蛋白參與的信號(hào)通路如下：肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、吞噬、鈣離子信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、抗原加工及呈遞、CD45/MAPK信號(hào)通路、自噬通路，這些信號(hào)通路都與結(jié)核分支桿菌感染相關(guān)，如圖3.3所示。然而，一些已證實(shí)與結(jié)核感染有關(guān)的固有免疫相關(guān)的信號(hào)通路并未在感染結(jié)核的樹(shù)鼩模型中發(fā)現(xiàn)，如：Toll-like受體信號(hào)通路、NOD-like受體信號(hào)通路和Mincle/Dectin-1/DC-SIGN介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。

6部分差異蛋白轉(zhuǎn)錄水平的分析

選取部分與結(jié)核感染相關(guān)的差異蛋白通過(guò)qRT-PCR在mRNA水平對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，如圖3.4所示：SHP-1、Coronin l、ASC、CD45、Cathepsin D、GSN、ITGB2、V-ATPase和STAT1表達(dá)上調(diào)，與iTRAQ結(jié)果一致；HSP90和Calnexin在mRNA水平并未上調(diào)，今后若開(kāi)發(fā)有相應(yīng)的抗體，可用Westernblot的方法再次驗(yàn)證；接著對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，與iTRAQ和PCR結(jié)果大致一致。

綠色方塊代表高劑量組與正常對(duì)照組相比和高劑量組與低劑量組相比都差異表達(dá)的蛋白，且這些差異蛋白與結(jié)核感染相關(guān)，紅色方塊代表高劑量組與正常對(duì)照組相比和高劑量組與低劑量組相比都差異表達(dá)的蛋白，且這些差異蛋白與結(jié)核感染不相關(guān)；綠色字體代表高劑量組與正常對(duì)照組相比或高劑量組與低劑量組相比差異表達(dá)的蛋白，且這些差異蛋白與結(jié)核感染相關(guān)，紅色字體代表高劑量組與正常對(duì)照組相比或高劑量組與低劑量組相比差異表達(dá)的蛋白，且這些差異蛋白與結(jié)核感染不相關(guān)。

M代表低劑量組，S代表高劑量組，橫坐標(biāo)代表蛋白名稱(chēng)，縱坐標(biāo)代表qRT-PCR2-ΔΔCt值

結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv或耐藥株（內(nèi)部編號(hào)94789）經(jīng)小鼠體內(nèi)兩次增毒，于羅氏斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲斜面培養(yǎng)3周的細(xì)菌經(jīng)5μm無(wú)菌濾器( Millipore公司)制成單細(xì)胞菌懸液，經(jīng)羅氏斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)，單細(xì)胞懸液菌濃度為1× 107 CFU /ml，單細(xì)胞懸液分裝凍存于－80℃低溫冰箱備用。

中緬樹(shù)鼩，1年齡，雄性，清潔級(jí)，體重100-170g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用得到了北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ILAC-PC-2012-003），動(dòng)物在感染前一周進(jìn)入醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

取樹(shù)鼩固定于保定袋中，暴露股靜脈，75%酒精擦拭消毒，靜脈注射250μl結(jié)核分支桿菌H37Rv單細(xì)胞懸液，感染劑量為2.5× 106 CFU（高劑量組），將H37Rv單細(xì)胞懸液稀釋1000倍，再靜脈注射250μl，感染劑量為2.5× 103 CFU（低劑量組），高低劑量組各感染樹(shù)鼩10只，4只為正常對(duì)照組，股靜脈注射同等體積的生理鹽水，所有實(shí)驗(yàn)均在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）進(jìn)行操作。

攻毒后每天觀察樹(shù)鼩活躍度，用紅外線體溫計(jì)監(jiān)測(cè)樹(shù)鼩體溫，每周稱(chēng)量一次體重。

感染后5W高劑量組取4只（其中一只病重死亡，死亡后及時(shí)解剖），低劑量組取4只，正常對(duì)照組取4只，8W高、低劑量組各取3只，11W高劑量組取3只，低劑量組取3只腹腔注射2%戊巴比妥鈉（劑量為40mg/Kg）麻醉后心臟采血處死；1.6ml血液放置血沉管中，輕柔顛倒混勻數(shù)次，垂直靜置血沉架上30分鐘后讀取1小時(shí)血沉值，約1.5ml血液放置血常規(guī)管，輕柔顛倒混勻數(shù)次，用動(dòng)物血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)；無(wú)菌取各組織，先后經(jīng)過(guò)生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，進(jìn)行組織病理分析、荷菌量檢測(cè)、蛋白質(zhì)譜分析和部分差異蛋白轉(zhuǎn)錄水平的分析。

將采集后的各組織用4%中性甲醛固定一周后，常規(guī)方法切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化。

無(wú)菌取各組織約50mg，漂洗后加1ml生理鹽水用玻璃組織研磨器研磨，組織懸液經(jīng)無(wú)菌生理鹽水按照1：10稀釋后取0.1ml接種羅氏斜面培養(yǎng)基，平行接種3管。以上2個(gè)濃度均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

病理組織片按常規(guī)方法脫蠟后染色，將脫蠟后的組織切片置于濕盒內(nèi)，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分鐘后用細(xì)流水傾斜沖洗玻片至初染液洗掉后再滴上復(fù)染液脫色復(fù)染，直至玻片上的組織呈淡藍(lán)色；鏡檢。

將高劑量組、低劑量組、正常對(duì)照組三組肺組織樣品于沸水中5分鐘滅活結(jié)核分支桿菌。送公司進(jìn)行蛋白樣品的裂解、濃度測(cè)定，蛋白酶解后用iTRAQ標(biāo)記各組肽段混合，用SCX柱進(jìn)行液相分離。基于Triple TOF 5600進(jìn)行LC-ESI-MS/MS質(zhì)譜分析。基于NCBI樹(shù)鼩核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（50461 sequences），利用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot2.3.02進(jìn)行檢索，選擇已經(jīng)建好的數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，并對(duì)質(zhì)譜質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析，包括差異蛋白的篩選，進(jìn)行GO、COG注釋?zhuān)町惖鞍譍eneOntology富集分析、pathway富集分析，以及多樣品間表達(dá)模式聚類(lèi)分析。隨機(jī)選取部分差異蛋白，用SYBR-Green的熒光定量PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分子驗(yàn)證。即從ITRAQ篩選的差異表達(dá)基因中選擇一部分與結(jié)核感染相關(guān)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌（結(jié)核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結(jié)核感染通常會(huì)累及肺、淋巴系統(tǒng)及其它多組織器官。除少數(shù)發(fā)病急促外，臨床上多呈慢性過(guò)程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)。感染后潛伏期4～8周，其中80%發(fā)生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發(fā)感染。

排菌的肺結(jié)核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數(shù)的受感染者沒(méi)有病癥，稱(chēng)為潛伏結(jié)核感染（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會(huì)發(fā)展至活動(dòng)性結(jié)核；若無(wú)適當(dāng)治療，一個(gè)活動(dòng)病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過(guò)50%。若潛伏感染者同時(shí)罹患免疫抑制，如愛(ài)滋病，每年就有10%的病發(fā)機(jī)率。

肺結(jié)核病程較復(fù)雜，臨床分型有：1、原發(fā)型肺結(jié)核(Ⅰ型):肺內(nèi)滲出病變、淋巴管炎和肺門(mén)淋巴結(jié)腫大的啞鈴狀改變的原發(fā)綜合征。兒童多見(jiàn)，僅表現(xiàn)為肺門(mén)和縱隔淋巴結(jié)腫大。 2、血型播散型肺結(jié)核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結(jié)核及亞急性、慢性血型播散型肺結(jié)核。 3、繼發(fā)型肺結(jié)核(Ⅲ型):可以出現(xiàn)以增殖為主、浸潤(rùn)為主、干酪病變?yōu)橹骰蛞钥斩礊橹鞯榷喾N病理改變。

結(jié)核菌進(jìn)入機(jī)體后，被巨噬細(xì)胞吞噬，結(jié)核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結(jié)核發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。結(jié)核病從感染、發(fā)病到轉(zhuǎn)歸均與多數(shù)細(xì)菌性疾病有顯著不同，宿主反應(yīng)具有特殊意義，反應(yīng)分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結(jié)核菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細(xì)胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結(jié)核菌的命運(yùn)各異。2. T細(xì)胞反應(yīng)期，由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫（CMI）和遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)（DTH）在此期形成，從而對(duì)結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結(jié)核菌可以持續(xù)存活，細(xì)菌與宿主處于共生狀態(tài)。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認(rèn)為是結(jié)核桿菌持續(xù)存在的主要場(chǎng)所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細(xì)菌不能增殖。宿主的免疫機(jī)制亦是抑制細(xì)菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結(jié)核菌的重新活動(dòng)和增殖。4.細(xì)胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長(zhǎng)能力、但不繁殖的結(jié)核菌。干酪灶一旦液化便給細(xì)菌增殖提供了理想環(huán)境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結(jié)核桿菌亦足以突破局部免疫防御機(jī)制，引起播散。

結(jié)核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結(jié)核性結(jié)節(jié)，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細(xì)胞、單核細(xì)胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結(jié)核結(jié)節(jié)及結(jié)合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變?yōu)楦衫覙痈淖儭＝Y(jié)核性炎癥的主要特是上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)及郎格漢斯細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室痰培養(yǎng)為菌陽(yáng)性，抗酸染色可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發(fā)病灶、淋巴管炎和肺門(mén)淋巴結(jié)結(jié)核合稱(chēng)為原發(fā)綜合癥，X線影像學(xué)上的典型表現(xiàn)為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結(jié)核菌素皮試轉(zhuǎn)陽(yáng)，95%的健康感染者原發(fā)綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復(fù)燃而發(fā)病,結(jié)核病起病緩慢，病程較長(zhǎng)。