APP_PSN雙轉基因癡呆癥小鼠模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預測，可誘導性是模型制造成功的關鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經生物學機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發的焦慮、學習記憶障礙及防護藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學結果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機制進行了基礎研究，認為CUMS模型會導致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認為采用慢性不可預測應激，35天可以造成大鼠和小鼠學習記憶障礙。

模型技術難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗模型的成功與否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，以避免動物產生適應性。相同的刺激因子應該隔3-7日再進行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預測應激模型，通過水迷宮、避暗等經典行為學指標，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質基礎機制指標，表明了慢性不可預測應激誘導老鼠學習記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進一步的改善學習記憶藥物的藥效學評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1、基因型鑒定

利用PrP-hAPPK595N/M596L轉基因小鼠和PrP-hPS1δE9轉基因小鼠進行雜交，所得新生小鼠1 周內剪鼠尾進行PCR 鑒定APP/PSN轉基因動物的基因表型鑒定, 保留陽性小鼠。轉基因小鼠在出生9 ～ 14 d 用剪趾法標記, 收集剪下的組織及鼠尾, 用堿裂解法提取基因組DNA , PCR 分別檢測APPK595N/M596L 及hPS1δE9基因的表達。APP基因PCR 產物長344 Kb , PSN基因PCR 產物長608 Kb。

PCR 鑒定APP 轉基因動物的凝膠電泳分析

2、APP/PSN雙轉基因AD小鼠的病理表現

5月齡出現老年斑，12月齡有大量老年斑形成。

3、APP/PSN雙轉基因AD小鼠的行為表現（水迷宮實驗）

經過檢驗前5 d 學習有效, 所有小鼠都能較快的找到平臺。隨后第6天撤出平臺, 進行空間探索實驗。Ethovision XT 監測分析軟件記錄小鼠在目標區域(即第4 、5 區)的穿梭次數和停留時間。Morris水迷宮試驗發現3 、6 、9 月齡APP/PSN雙轉基因小鼠空間探索實驗結果與同月齡野生型小鼠相比有顯著差異, 較同月齡野生型C57BL/6J小鼠學習及記憶能力降低。

Morris 水迷宮第六天空間探索實驗結果比較

利用PrP-hAPPK595N/M596L和PrP-hPS1δE9雙轉基因培育而成。背景品系是C57BL/6J，啟動子為Mouse prion protein（PrP）, 靶基因信息：Human presenilin 1 and APP。

一、 AD簡介

臨床癥狀主要表現為記憶、認知、理解、判斷推理能力以及社會適應能力、個人生活能力慢性進行性減退，最終發展為嚴重癡呆。

病理表現主要為大腦內出現老年斑，神經原纖維纏結，神經元丟失等。

發病機制主要包括tau蛋白過度磷酸化，淀粉樣蛋白沉積，載脂蛋白E的多態性，淀粉樣前體蛋白變異及其轉化過程發生改變，氧化應激和代謝損害等。

二、 APP，PS1與AD

APP基因位于染色體21q21.3，由20個外顯子和若干內含子組成，由于基因轉錄后剪接方式的不同，所得的mRNA可翻譯生成數種亞型，其中最主要的為APP695，APP751，APP770。APP作為一種管家基因，在多種組織中均有表達，但不同組織表達的APP亞型有所不同，其中APP695在腦組織中表達量最多，APP基因突變引起的AD病例只占總病例的一小部分，但是具有代表性。PS1基因位于14q24.3，到目前為止發現90多個突變點，與早老性AD的發生發展相關。

APP蛋白是一種I型擴莫蛋白，在哺乳動物中有兩個同源蛋白APLP1，APLP2。APP翻譯后經過N-和O-糖基化，磷酸化以及絡氨酸硫酸化等修飾。經過兩種途徑進行水解，即不產生Aβ的途徑和產生Aβ的途徑。正常大腦中，APP主要經過α分泌酶進行水解，其在Aβ區段由α分泌酶水解，從而阻止Aβ的形成。一旦APP水解異常，將會導致大腦內Aβ的聚集，形成老年斑。PSI蛋白是一個內含有467個氨基酸的多次跨膜蛋白，定位于內質網，高爾基體及細胞表面。PSI作為γ分泌酶的催化亞基，其表達異常導致APP水解異常，從而參與了大腦內老年斑的形成。